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质粒构建如何选择载体

质粒构建如何选择载体



把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。

P.S. 基因工程所用的 vector 实际上是 DNA 分子,是用来携带目的基因片段进入受体细胞的 DNA。

选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述 3 点:

1. 构建 DNA 重组体的目的,克隆扩增/表达表达,选择合适的克隆载体/表达载体。

2. 载体的类型:

克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb 选质粒。

表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表达载体。

对原核表达载体应该注意 3 点:选择合适的启动子及相应的受体菌;用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

3. 载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不产生阅读框架错位。

选用质粒(常用)做载体的 4 点要求:

选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5 kb)→不易损坏,在**里面拷贝数也多(也有大载体);

一般使用松弛型质粒在**里扩增不受约束,一般 10 个以上的拷贝,而严谨型质粒 < 10 个。

必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地;

必需有易检测的标记,多是***的抗性基因,不特指多位 Ampr(试一试)。

无论选用哪种载体,都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割,获得分子,以便于与目的基因片段进行连接。

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