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Western Blot实验总结

Western Blot实验总结

1.缓冲液的选择,是用PBS/PBST,还是用TBS/TBST?

(1)PBS/PBST不适合AP系列,TBS/TBST适合AP和HRP体系。

(2)另外,做磷酸化蛋白的WB,PBS不合适

2.如果用HRP体系,那么不能用叠氮钠做防腐剂。因为叠氮钠会抑制HRP的作用。

3.WB中抗体的选择:

单抗专一性高,但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别。多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。

4.简易的WB——“不知道是否有表达,比如抗体少还要摸条件(稀释度),可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件,省点时间省点试剂”

5.WB中Tween-20的作用:

吐温是一种非离子型表面活性剂,可以洗掉一些非特异性结合的蛋白和抗体,降低背景。

6.ECL荧光淬灭的问题:

二抗浓度过高,HRP浓度过高,会超速催化底物生成产物使膜发黄。所以二抗浓度太低了不行,太高了由于会出现卒灭的现象也行不通。

(1)弱信号或者无信号:在HRP高的情况下,来不及压片就已耗竭底物!解决办法:加入底物后迅速进入暗室,压片10秒钟!或者适当降低2抗浓度。

(2)反影(白色条带,黑色背景) :条带处HRP很快将底物耗竭,则不发光,不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。解决方法同上。

(3)另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊,但条带中心是空的白色,原因和上面的一样,主要是条带中心耗竭底物引起的,也可以在暗室看到中空的荧光带,但与上面的区别主要在于特异性要好一些,若继续发展则就是弱信号或者无信号,解决方法同上。

7.western 背景深原因:

(1)封闭的不好。封闭试剂不合适等。

(2)洗涤不充分。洗涤液的量过低等。

(3)样品浓度过高。

(4)抗体浓度(特别是二抗浓度)过高。

8.Western中的正反面问题。

,PVDF膜本身是不区分正反面的,两面都可以用。但是转膜之后就分为与胶直接接触的一面和不直接接触的一面。有一种说法认为转膜后,蛋白存在于与胶直接接触的一面,因此,加ECL时要加在与胶直接接触的那面上。


另一种说法则认为,转膜后蛋白并不是简单的粘在膜上,而是嵌入膜中了,所以膜的两面都有蛋白,ECL随便加在哪一边。个人同意第二种说话,但是由于转膜的程度不同,两面所含的蛋白量也可能不同。

9.在做Western Blot时,PVDF膜用甲醇浸泡的目的?

PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

10.ECL是什么?

ECL(electronic ChemiLuminescence)是指一种方法、原理,是利用电解的氧化还原产物之间或与体系中某一组分进行化学反应而发光的一种分析法.Western-blotting 中指电化学发光**法。其原理:辣根过氧化酶使试剂中的发光物(Luminol)氧化并发光,而试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。Luminol发生氧化降解,并发射波长为428nm的光,此光可经X光片(放射自显影片)感光记录下来。

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