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详细内容

实验外包助手 SDS-PAGE凝胶电泳实验外包

一.实验外包助手 SDS-PAGE的原理

SDS-Page电泳主要利用聚丙烯酰胺的分子筛效应分离蛋白质和核酸,SDS-PAG蛋白质电泳分析可从蛋白质亚基分子量的大小就分离蛋白质。


二. SDS-PAGE的种类

1、连续系统:电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。

2、不连续系统:缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度均不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

三. 实验外包助手SDS-PAGE实验操作

1、试剂配制(注意:所用试剂均需分析纯)

1)5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸,Tris-HCl,pH: 8.8:称取181.71g三羟甲基氨基甲烷加适量超纯水溶解,用盐酸调pH值至8.8,加超纯水定容至1000ml。


2)29.2%丙烯酰胺-0.8% N,N’-甲叉双丙烯酰胺:称取29.2g丙烯酰胺,0.8g N, N’-甲叉双丙烯酰胺,加超纯水溶解,并定容至100ml,混匀后用滤纸过滤,避光保存。

注意:丙烯酰胺为剧毒试剂,易被皮肤吸收,使用过程中勿必要戴橡胶手套。


3)10%十二烷基硫酸钠(SDS):称取1g十二烷基硫酸钠,加超纯水溶解,并定容至10ml,室温保存。


4)四甲基乙二胺原液(TEMED)


5)10%过硫酸铵:称取1g过硫酸铵,加10ml超纯水溶解。


6)1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸,pH: 6.8:称取12.114g三羟甲基氨基甲烷(Tris-Base)加适量纯化水溶解,用盐酸调pH值至6.8,加超纯水定容至100ml。


7)10倍电极缓冲液贮液:称取甘氨酸288.26g,三羟甲基氨基甲烷60.57g,十二烷基硫酸钠20g,加超纯水定容至2L。


8)非还原型2×样品缓冲液:称取三羟甲基氨基甲烷3.03g,溴酚蓝0.02g,十二烷基硫酸钠8g,盐酸1.89ml,甘油40ml,加超纯水溶解并定容至200ml,混匀,分装小管,2~8℃储存。


9) 还原型2×样品缓冲液:称取三羟甲基氨基甲烷3.03g,溴酚蓝0.02g,十二烷基硫酸钠8g,盐酸1.89ml,甘油40ml,加超纯水溶解并定容至200ml,再加入β-巯基乙醇40ml,混匀,分装小管,2~8℃储存。


10)考马斯亮蓝染色液:450ml乙醇,450ml纯化水,混匀,加入称好的2.5g考马斯亮蓝R-250及100ml冰醋酸,放磁力搅拌器上搅拌至少8小时,过滤即得。


11)考马斯亮蓝脱色液:450ml乙醇,450纯化水,混匀,再加100ml冰醋酸,混匀即得。


12)分子量标准蛋白:冻干粉产品按说明书溶解稀释后,经100℃水浴,放冷后分装于小管中,-20℃保存;液体产品则直接分装于小管中,-20℃保存,标签上注明使用前需水浴,有效期6个月。


2、实验外包助手样品处理

取量待检样品按蛋白含量用超纯水稀释至1mg/ml,取稀释好的样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个eppendorf 管中混合。分子量标准蛋白的处理方法按标签说明,如需水浴则同样品一起100℃加热5-10min,取上清点样,

如不需水浴则直接上样。

3、凝胶配置

制备分离胶:将配好的分离胶灌入电泳槽中,加水覆盖,室温下聚合。(室温不同,聚合时间不同)


凝胶配方如下(两块胶):

凝胶种类

分离胶

浓缩胶

凝胶浓度

8%

10%

12%

15%

5%

超纯水

6.89ml

5.89ml

4.89ml

3.39ml

3.44ml

30% Acrylamide/Bis Solution

4.0ml

5.0ml

6.0ml

7.5ml

0.83ml

1.0M Tris (pH 6.8)

---

---

---

---

0.63ml

1.5M Tris (pH 8.8)

3.8ml

3.8ml

3.8ml

3.8ml

---

10% SDS

150μl

150μl

150μl

150μl

50μl

10% APS

150μl

150μl

150μl

150μl

50μl

TEMED

9.0μl

9.0μl

9.0μl

9.0μl

5.0μl

制备浓缩胶

待分离胶聚合后,用滤纸吸去上面的水层,再灌入浓缩胶(配方见上表),插入样品梳,注意避免气泡出现。


4、SDS-PAGE电泳

调胶:拔掉SDS胶上的梳子,并用小针调整齿的位置(使它们都平行)。

点样:用20µL的小枪头,吸煮过的样品10µL,对准胶孔点样,注意不要把样品点在外面。使用适当的分子量蛋白marker。

电泳:电泳仪正负极接好,打开电源。浓缩胶:电压 low 100V

分离胶:电压 high 150V。

卸胶:等胶内的所有的蓝色都跑出去,电泳停止,一般时间为1-2小时左右。把胶板从电泳仪上卸下,用刀片把胶板撬开,胶的浓缩胶部分割除;

染色:放入考马斯亮蓝R-250染色液中进行常温过夜染色;

脱色:将过夜染色的SDS-PAGE胶放入脱色液中进行脱色,直到背景发白。

5、数据处理:

扫描:将干燥的凝胶放入扫描仪,扫描后计算纯度。

纯度计算:按峰面积归一法计算目标蛋白的纯度。

分子量的计算:以分子量标准蛋白的对数分子量与其迁移率作标准曲线,代入样品迁移率计算该样品的分子量。


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