脊髓继发性损伤大鼠动物模型的制作

急性脊髓损伤后开始时常为不性，后结果常为两种损害机制引起：原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤(S)。继发性脊髓损伤为伤后几小时至几天发生的一系列损伤激活的自身破坏过程，使初病灶周围原来完整的组织发生自身破坏性病变， 周围神经功能损害逐渐发展。所产生的脊髓损害远远超过了原发性损伤。

1 材料与方法

1.1 实验材料

雄性SPF大鼠60只，电子显微镜，化学试剂。

1.2 实验动物分组

本实验选用雄性健康SPF大鼠60只，体重260～300 g，正常对照组：20只。动物模型组的组织化学染色：20只。动物模型组的电子显微镜组：20只。

1.3 实验方法

1.3.1 继发性脊髓损伤大鼠模型制备 1%****钠腹腔麻醉动物(30 mg/kg)，俯卧位固定于立体定位仪上。以T10为中心暴露上下位锥板，咬除椎板，保持硬脊膜完整。在T10阶段节段脊髓表面垫一曲度与脊髓表面一致的3 mm×8 mm塑料片，用30 g重物垂直压迫T10节段脊髓10 min，逐层缝合肌肉皮肤。符合以下条件的大鼠归入损伤组：压迫时身体痉挛性颤动、尾巴痉挛性摆动、双下肢及躯体回缩样扑动；压迫后硬脊膜内充血或水肿，双下肢呈迟缓性瘫痪，斜板实验测定大角度<30°。对照组大鼠只暴露脊髓。术后不同时间点处死动物，4％多聚甲醛灌注固定，无菌条件下取损伤节段脊髓组织约1.0 cm，液氮保存或石蜡包埋。

1.3.2 组织染色标本的取材 对实验动物用1％****钠(40 ml/kg)腹腔麻醉后开胸，经左心室70滴/min滴入1％肝素钠的生理盐水500 ml，同时剪开右心耳。继用0.1 m磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)配制的固定液(含4％多聚甲醛)灌流固定。取出实验动物的脊髓组织，放入含4％多聚甲醛PBS的固定液中进行后固定大约2 h，之后将实验动物的脊髓组织切成薄片移入含20％蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至组织薄片沉底，经水包埋，恒冷箱连续横切片，片厚20 μm。经OCT包埋，恒冷箱连续切片，片厚16 μm，-70℃保存备用。

1.3.3 电子显微镜组织标本的取材

在1%****钠(40 mg/kg体重)腹腔麻醉下，用含1%肝素钠生理盐水200 ml快速冲洗后，用2%多聚甲醛及2.5%戊二醛的0.1 m磷酸缓冲液250 ml灌流固定，灌流后立即取脑，切取脊髓组织块置于4℃，2.5%戊二醛中固定24 h，经1%锇酸固定1 h后，常规脱水，Epon812包埋，L.K.B超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，日立H-600透射电镜观察并拍片。

1.3.4 尼氏染色

冰冻切片吹干，经PBS漂洗5 min 3次，将切片置入1%甲苯胺蓝溶液中37℃孵育90 min，取出后用蒸馏水冲洗，PBS漂洗5 min 3次，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。

2 结果

2.1 尼氏染色结果

正常对照组大鼠脊髓前角细胞的尼氏染色切片上，神经元数量较多，排列紧密，形态完整，细胞浆有内尼氏体。

动物模型组大鼠脊髓，肉眼可见大鼠脊髓损伤局部组织充血。镜下可见SCCI后3~6 h损伤局部神经元核固缩，胞体缩小，胞质深伊红染色，成为红色是神经元。伤后1~3 d，轴突肿胀，出现空泡，白质内神经髓鞘散乱、崩解破裂。伤后3~7 d胶质细胞增生明显，可见卫星现象及鬼影细胞。伤后14 d，损伤段脊髓变细部分灰质崩解坏死，可见囊腔形成。正常神经元数量明显增多，细胞丰满，泡浆内尼氏体丰富。

2.2 透射电镜结果

动物模型组大鼠脊髓前角神经元细胞：核皱缩、核膜部分溶解、消失；线粒体肿胀、嵴紊乱甚至缺失；内质网扩张、脱颗粒；高尔基体扁平囊腔扩张；突触数量减少、前后膜融合、突触小泡不清或出现聚集。

根据尼氏染色及电镜观察说明继发性脊髓损伤大鼠模型制备成功。