糖尿病及糖尿病肾病动物模型的建立

　　近年来，随着人们生活水平的提高以及饮食习惯的改变，糖尿病(diabetes mellitus,DM)的发病率也逐年升高。随着人口的增长，糖尿病患者的增多以及病程的进展，糖尿病肾病(diabetes neuropathy,DN)发生率也随之增加并呈年轻化趋势[1]。糖尿病肾病不仅可以增加心脑血管的发生率，也是导致糖尿病患者致死、致残的重要原因之一[2]，其每年给患者及家属、社会、都带来很大的负担。因此，如何预防和**糖尿病及其并发症就为人们所关注。关于糖尿病肾病的发病机制并不清楚，其是由多因素共同作用的复杂的疾病，因而研究其发病机理成为近年来的研究热点。而发病机理的研究多是从动物模型为基础，所以研究糖尿病及糖尿病肾病的动物模型具有很重要的意义。因此我们应用高脂高能量饲料加单次腹腔小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)来诱导动物，探讨是否可以成功建立糖尿病肾病的动物模型，以备后续实验的进行。
1 实验材料
1.1 实验动物:SPF级雄性Wistar大鼠26只，体重约220-250g左右及其普通饲料和高脂高能量饲料，均由广西医科大学动物实验中心提供，高脂高能量饲料配方热比为碳水化合物25%、蛋白质28%、脂肪45%，普通饲料配方热比：碳水化合物56%、蛋白质22%、脂肪10%，其它为维生素、微量元素等。动物自由摄食饮水。动物饲育环境按GB14925-2001要求，相对湿度为40%-70%，室内温度为20℃-22℃[3,4]。
1.2 材料:微量血糖测定仪及血糖试纸（罗氏公司），柠檬酸缓冲液，蛋白酶抑制剂混合片，其它试剂为国产纯。
2 实验方法
2.1 大鼠适应性地饲养一周后，随机选取20只给予高脂高能量饲料喂养，另取6只继续给予普通饲料喂养，为正常对照组。
2.2 8周后，高脂高能量饲养的大鼠给予小剂量链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)按剂量25mg/kg单次腹腔注射（将STZ溶于0.1 mol／L柠檬酸缓冲液中，pH 45,大鼠注射STZ前禁食12h）来诱导动物建立糖尿病动物模型，普通饲料饲养的大鼠予以注射等量的柠檬酸缓冲液,大鼠继续原条件饲养。
2.3 3天后取尾静脉血测末梢血血糖，把血糖≥16.7mmol/L视为高血糖大鼠，高血糖大鼠继续予以高脂高能量饲料，此后每3天检测1次血糖，当血糖稳定≥16.7mmol/L者看做糖尿病大鼠，视作建模成功，为糖尿病组，正常对照组继续给予普通饲料喂养。
2.4 用金属代谢笼收集糖尿病大鼠的尿液，连续收集3天，每次收集6小时尿后，立即10000g，4℃离心10min，除沉淀，按照试剂盒推荐比例（1片药配10ml液体）放入蛋白酶抑制剂混合片，-80℃超低温冰箱保存并检测尿液中尿白蛋白/尿肌酐的比值，收集期间禁食不禁水。间隔4周重复检测，连续3次检测尿白蛋白/尿肌酐（Alb/Cr）均达到30-300mg/g，诊断为早期肾病，并分入早期糖尿病肾病组。
3 实验结果
3.1 建立糖尿病模型:注射链脲佐菌素4周后，20只大鼠中有11只大鼠血糖稳定≥16.7mmol/L，成功建立糖尿病大鼠动物模型11只，成模率为55%。
3.2 建立糖尿病肾病模型:糖尿病大鼠继续予以饲养高脂高能量饲料，并按上述方法检测尿白蛋白/尿肌酐比值，至第28周时糖尿病组有7只大鼠连续3天尿液中尿白蛋白/尿肌酐的比值均达到30-300mg/g，成功建立糖尿病肾病动物模型7只，为糖尿病肾病组，成模率为63%。
4 讨论
，国内外已知的建立糖尿病动物模型的方法有很多种，如实验性糖尿病动物模型(experimental diabetes animal model）、自发性糖尿病动物模型(spontaneous diabeles animal model）、转基因糖尿病动物模型(transgenic diabetes animal model）[5]。其中实验性糖尿病动物模型的建立有胰腺切除法、化学药物特异性破坏胰岛 细胞、手术及药物联合制作糖尿病模型、病毒诱导方法。其中胰腺切除法虽然是早的糖尿病动物模型复制方法，但因其操作繁杂，而且一般用于较大的实验动物，所以使用受到限制，故用化学药物诱导制作糖尿病动物模型就成为很普遍的方法，现在运用也比较广泛。其中化学药物中常使用的是链脲佐菌素（STZ），因其诱导糖尿病模型成模率高、对机体组织毒性作用小、用量少、动物存活率高，成为国内外使用较多的制备糖尿病动物模型的药物。STZ通过自由基的作用有选择性地破坏了动物的胰岛B细胞，使B细胞功能受损，胰岛素合成分泌减少，引发糖尿病。高糖高脂喂养1～2个月的大鼠，再加小剂量一次腹腔注射STZ即可建立具有外周胰岛素抵抗和胰岛功能轻度受损的糖尿病动物模型，与人2型糖尿病的发生、发展过程相似，且STZ用量小，减少了对其他组织如肝、肾的损害。国外有学者报道选用雄性大鼠制造模型的成模率明显高于雌性大鼠，所以在本实验中我们使用STZ诱导Wistar雄性大鼠建立糖尿病肾病大鼠模型[6,7]。

本实验采用高糖高脂高能量饲料喂养后加单次腹腔注射小剂量STZ(25mg／Kg)诱导糖尿病大鼠模型，3天后取尾静脉血测血糖，连续监测血糖均≥16.7mmol/L认为糖尿病大鼠建模成功。随着病程的进展，尿白蛋白/尿肌酐比值升高，提示肾脏的肾小球滤过功能受损，肾功能下降，说明本实验模型大鼠符合糖尿病肾病特征。在本实验中，糖尿病肾病大鼠还有4只动物模型未建立，说明大鼠之间的个体差异也较大。肾小球滤过功能障碍主要是由肾小球基底膜通透性增加或者肾小管重吸收障碍有关。肾小球基底膜通透性增加主要由滤过间隙增大及电荷屏障功能障碍引起，导致尿中大量蛋白流失。尿蛋白主要成分是白蛋白，亦可包括其它血浆蛋白成分，与尿蛋白的选择性有关。肾小管上皮细胞重吸收和再分泌对蛋白尿的形成也有的影响。尿蛋白的量还受血浆蛋白浓度及肾小球滤过率等因素的影响，如血浆蛋白浓度严重降低时，尿蛋白排出量减少，反之，静脉输注蛋白制剂时，尿蛋白排出量可一过性增加，此外药物如非固醇类**药、血管紧张素转换酶抑制剂及受体阻滞剂，通过影响肾小球灌注、跨膜压等可使尿蛋白量发生改变。尿白蛋白/尿肌酐比值是测定糖尿病肾病肾功能的一个新的指标，有报道指出其对诊断早期糖尿病肾病有的作用，因其留取尿液方便、可以排除血浆蛋白浓度以及尿量的影响，所以是近年来用于监测尿蛋白排出情况的一种新的可靠方法，能够可靠地反映24h尿蛋白量。故本实验采用尿白蛋白/尿肌酐来测量尿蛋白的排出情况。
关于糖尿病及糖尿病肾病的基础研究多是通过动物模型进行的，成功建立动物模型是关键，本文仅做了小小的探讨，在以后的实验中还可以进行更加深入的研究。