负重站立法建立骨骼肌静力性损伤动物模型的实验研究

1 材料与方法
1.1 动物分组 健康纯系雄性SD大鼠72只（8周龄），随机分成对照组（CON）、4周实验组（4周）、3周实验组（3周）、2周实验组（2周）、1周实验组（1周）和3 d实验组（3 d），每组12只，各组体重无显著性差异。分笼饲养，适应2 d后分别处置。饲养环境温度为（22±2）℃，相对湿度为45%～55%，自然光照，自由饮食、饮水。实验动物分组见表1。
1.2 大鼠静力性运动实验台的设计 设计自制空心实验台，台上安装可调节高度的铁架。铁架横梁表面有用以固定大鼠前肢的光滑凹槽。在铁架下方台面钻3个圆孔，2孔在前，相距3 cm，其连线距铁架横梁投影线后5 cm并与之平行，用于施加负荷的砝码通过而悬挂在大鼠踝关节上，同时起到固定大鼠后肢保持静力性运动的作用；另1个孔在前面2孔连线中点后2 cm处，用于实验中容纳鼠尾，避免鼠尾支撑。 　　1.3 大鼠静力性运动方式 实验时将大鼠前肢固定在铁架横梁上，调节高度使其两侧后肢踝关节处于跖屈位支撑站立（以跖趾关节大支撑不离开台面为标准），并在两侧踝关节处各施加50%体重的负荷（图1）。此种施加负荷方式可以双侧腓肠肌的肌纤维处于静力性收缩的募集模式。每天上、下午各训练1 h，分别训练3 d、1周、2周、3周和4周。大鼠均在全部训练结束次日宰杀取材。对照组不训练，其它条件与实验组相同。运动训练安排详见表2。
1.4 取材和标本制备
图1 实验大鼠的运动方式
1.4.1 取材 称取体重，眼底取血，断头处死。快速取左后肢腓肠肌内侧头中下部1/3处约0.5 cm×0.5 cm×1 cm肌组织，入4%中性多聚甲醛固定。在每组中随机取3只动物左后肢腓肠肌同一位置约0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm组织块，立即入3%戊二醛固定。制备血清，-80℃保存待测。
1.4.2 石蜡切片制备及HE染色 将4%中性多聚甲醛固定的肌组织块经脱水、透明后，石蜡包埋，横向和纵向连续切片，厚度为5 μm。常规HE染色。
1.4.3 电镜切片制备及染色 将3%戊二醛中固定的肌组织块入0.18 mmol/L蔗糖缓冲液浸泡后冲洗，1%锇酸固定，梯度丙酮脱水，浸酯后包埋。连续超薄切片，厚度为500～800 A°。醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色。
1.5 测试指标与方法
1.5.1 腓肠肌常规组织学观察 将HE切片置于OLYMPUSBX51型光学显微镜下，以10×40放大倍数取视野四角和中央共5个区域观察。
1.5.2 腓肠肌透射电镜观察 将电镜标本置于JEM-100CX Ⅱ型电子显微镜下，以7 200～36 000倍对视野的四角和中央共5个区域进行观察、拍照。
1.5.3 血清肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）活性的测定 采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，严格按说明书进行操作。
1.6 数据统计处理 数据均以平均数±标准差（Mean±SD）表示，使用SPSS10.0统计软件进行处理，采用单因素方差分析进行各组间的差异显著性检验。显著性水平为P﹤0.05。
2 实验结果
2.1 大鼠体重的变化 由表3所示，施加静力性负荷期间各实验组体重均显著低于对照组同时期体重（P<0.01），而且随着时间的延长，这种趋势更加显著。4周组大鼠的体重在第1周内没有增加（P>0.01），其余时间也呈缓慢增加趋势；3周组体重在第1周出现负增长（P<0.05），其余时间增长也极为缓慢；而2周组、1周组和3 d组体重在施加负荷期内均持续负增长，且施加负荷结束时体重均显著低于开始时（P<0.01）。
2.2 大鼠一般状态的变化 大鼠在施加负荷前均神态安静，对食物的反应较敏感，受到捕捉时有明显的逃避反应。施加负荷时，大鼠明显烦躁不安，训练后逃避反应明显下降，有些基本无逃避反应，而且后肢肌肉触感明显较硬，不愿站立，需匍匐3～5 min才可行走。在施加负荷至第1周后，普遍出现反应迟钝、萎靡不振等现象。
2.3 腓肠肌常规组织学的变化 对照组的骨骼肌表现为肌膜清晰，肌纤维明暗条纹规则整齐，未见变性、坏死（图2）。
3 d组可见与肌束膜连接处肌纤维细胞核增多，明显的小片状肌纤维溶解、坏死，肌膜模糊、不连续，大量**细胞浸润，间质成纤维母细胞增生（图3）。
1周和2周组表现相似，与肌束膜连接处肌纤维细胞核增多，肌纤维变性，肌膜模糊、不完整，但**细胞浸润和成纤维母细胞增生明显减少（图4、图5）。
3周组可见多灶性肌纤维变性，局部肌纤维横纹模糊，肌膜不完整，**细胞浸润和成纤维母细胞增生较1周和2周实验组增多（图6）。
4周组多见肌纤维变性，**细胞浸润和成纤维母细胞增生较明显，局部肌纤维正常结构丧失，肌膜模糊（图7）。
2.4 腓肠肌超微结构的变化
对照组的骨骼肌肌原纤维排列规则，A、I带及Z线清晰整齐（图7）。
3 d组与1周组骨骼肌超微结构的变化主要是Z线出现异常，具体表现为锯齿状、斜坡状（Z线流），局部Z线扭曲、断裂，偶见肌丝扭曲、肌节错位现象。2周、3周和4周组除上述异常现象外，还较常见肌丝排列紊乱、扭曲，肌节结构模糊，无法区分A带、I带，甚至肌节断裂、消失等现象。以上各种超微结构的典型变化见附图8～12。
2.5 血清肌酸激酶活性的变化 由表4可见，各实验组大鼠血清肌酸激酶（CK）活性较对照组均显著升高（P<0.01）。不同时间实验组间的变化趋势表现为3 d～1周时持续上升，1周～4周逐渐回落，其中第4周时与第1周相比有显著性差异（P<0.05），其余各实验组间均无显著性差异。
2.6 血清乳酸脱氢酶活性的变化 由表4可见，各实验组大鼠血清乳酸脱氢酶（LDH）活性与对照组相比均显著升高（P<0.01）。不同实验组间的变化趋势表现为3 d时已达到一个峰值，1～3周明显回落，与3 d组相比均有显著性差异（P<0.05或 P<0.01），至第4周时又明显升高，且与第1周和第2周时有显著性差异（P<0.05）。
3 讨 论
3.1 施加不同时间静力性负荷对大鼠体重的影响 体重的下降常提示存在身体机能状态下降和对外界刺激因素的不适应[7]。本研究中各实验组大鼠的体重在施加静力性负荷前后的变化说明，在3 d～4周后肢负重站立的静力性训练中，大鼠始终处于对施加负荷和运动方式的不适应或勉强适应状态。大量研究表明，肌肉运动性损伤的直接诱因是肌肉受到不习惯或不适应的负荷所致[8]。因此，本研究的运动负荷和运动方式对建立骨骼肌静力性负荷所致损伤动物模型是适合的。
3.2 施加不同时间静力性负荷对大鼠腓肠肌微观结构的影响 肌肉在进行静力性收缩时与离心性和向心性收缩有不同的特征，此时肌肉不发生长度变化，但肌张力持续作用的时间较长，肌内压持续保持较高状态，使肌肉血供和代谢产物排出产生障碍。由此提示，肌肉静力性运动后微观结构的变化可能与离心性和向心性收缩方式所致变化有所不同。另外在实际工作和运动训练中，由于肌肉不适或酸痛而停止工作或训练的现象较少见，因此研究连续施加静力性负荷对骨骼肌的影响比研究施加一次性静力性负荷更具实际意义。 　　本研究的结果表明，施加3 d～4周静力性负荷均使骨骼肌微观结构发生了改变，而且3周和4周时**细胞浸润和成纤维母细胞增生较1周和2周时更明显， 2～4周时超微结构改变较3 d～1周时更严重。由于本实验对大鼠后肢施加的是一种相对恒定的负荷，甚至在体重出现负增长时负荷还有所降低，因此表明连续施加相同强度和负荷量的静力性负荷可以产生对骨骼肌微观结构的累积性损害。
许多学者认为运动性肌肉微损伤结构的变化不具有累积性损害作用。Nosaka和Byrnes等均发现重复性离心训练并不影响次训练后延迟性肌肉酸痛的恢复[9，10]。马建等[11]对家兔进行4 d或7 d离心疲劳训练后发现，4 d时胫前肌纤维的变性、吞噬、间质水肿和炎细胞浸润程度均非常明显，7 d时明显减少或消失。分析以往研究与本研究结果存在差异的原因，我们认为运动性肌肉微损伤结构的变化是否具有累积性损害作用，并不仅仅决定于强度和负荷量，还与运动方式有关。劳动生理学的调查证明[12]，静态负荷较动态负荷更容易引起肌肉的疲劳和损伤。本研究中大鼠一般状态的表现和体重的变化趋势，表明长时间、连续的静力性运动是机体不易适应的运动方式，因此导致骨骼肌微观结构的损伤和程度的累积。这可能与肌肉工作特征和代谢方式有关。由此提示机体长期、重复的处于某种强迫体位或进行维持某种固定姿势的静力性运动，可能是导致肌肉慢性损伤的潜在性因素。
另外，有研究认为机械牵拉是离心性收缩所致肌肉损伤的始动因素，其中肌张力起主要作用[13，14]。本实验中常规组织学的观察可见与肌束膜连接处肌纤维细胞核增多，肌纤维变性在与肌束膜连接处也较常见，提示在骨骼肌长时间静力性运动中，肌张力的持续作用可能是造成肌纤维损伤的重要因素。
3.3 施加不同时间静力性负荷对大鼠血清肌肉酶活性的影响 正常生理状况下血液中CK、LDH等肌肉酶的含量甚微。在运动过程中，由于肌膜易于受到损伤，导致通透性增加，使其进入血液，从而引起血中肌肉酶活性增高[13，14]。因此，它们在运动后含量的变化可以间接反映肌细胞的损伤。本研究观察了施加不同时间静力性负荷后大鼠血清CK和LDH活性的变化，希望从另一角度来检验模型的建立是否成功。
本研究的结果表明，施加不同时间静力性负荷后，大鼠血清CK和LDH活性与对照组相比均显著升高，血清CK 3 d～1周时持续上升，1周后逐渐回落，至第4周时仍显著高于对照组。血清LDH活性的变化趋势与CK略有不同，具有双相特征，表现为3 d时已达到一个峰值，1～3周明显回落，至第4周时又明显升高，且与第1周和第2周时有显著性差异。
这表明施加静力性负荷导致骨骼肌细胞膜损伤，其屏障作用减弱，通透性增加。这与以往多数研究结果一致[14，15]，且与本研究中组织学结构出现肌膜模糊、不连续的变化相符合，故从另一角度说明本模型的静力性负荷造成了骨骼肌损伤。
然而，也有学者对用血清肌肉酶活性来评价肌肉损伤的作用提出了质疑。Van Der Meulen[16]和Manfredi[17]均报道肌酸激酶的升高与活检标本肌内是否损伤没有联系。上述研究的不同结果可能与采用的肌肉标本不同有关。由于肌肉损伤**于肌肉内的局部[18]，因此肌肉活检时若未检到这样小范围的损伤就可能造成研究结果的不同。
本研究中血清CK和LDH活性的变化与骨骼肌微观结构损伤的现象基本相符，但时相并不一致。这可能与骨骼肌并不是血清中肌肉酶的来源有关。殷劲等[19]发现，家免在剧烈运动致疲劳后，血清中LDH的两种同工酶LDHl及LDH5均升高，但来自骨骼肌的LDH5的活性低于心肌释放的LDHl，很显然该运动对心肌和骨骼肌均产生了影响。一般认为，运动对机体的影响是多组织的而不是单一的，血清中CK、LDH在运动后的增加是多组织释放的总效应，因此造成它们活性的变化与骨骼肌微观结构损伤的时相不一致。据此本研究认为血清CK和LDH可以作为反映静力性负荷所致肌肉损伤的间接指标。
综上所述，本研究采用的持续3 d～4周的大鼠后肢负重站立的静力性负荷导致骨骼肌发生了损伤，说明模型的建立是成功的。与以往模型相比，本模型在肌纤维募集方式、肌肉工作性质与自然生理状态的符合、较少的附加影响因素以及运动的可重复性等方面具有明显的优势，因此更适合进行骨骼肌静力性负荷所致损伤的发生、修复与再生机制的研究。
4 结 论
1）持续3 d～4周的大鼠后肢负重站立的静力性负荷可诱发骨骼肌发生损伤，可用于骨骼肌静力性负荷所致损伤的研究模型，此模型在肌纤维募集方式、肌肉工作性质与自然生理状态的符合、较少的附加影响因素以及运动的可重复性等方面具有明显的优势。
2）同等强度和负荷量的连续的静力性负荷可以产生对骨骼肌微观结构的累积性损害。
3）血清CK和LDH可以作为反映静力性负荷所致肌肉损伤的间接指标。