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上海达为科生物科技有限公司

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详细内容

采用低氧训练方法建立大鼠心肌组织血管新生动物模型

随着低氧训练研究的不断深入,研究者们发现低氧训练除了应用于运动训练提高运动能力之外,还对健身、**的**也有很大作用。目前,已有关于低氧运动**心血管**、糖尿病、肥胖、贫血等**的研究报道。

临床上促进****新生的方法主要采用**性血管新生疗法,如使用激光进行心肌内血管重建术;给予促血管生长因子;细胞移植;****等,但这些**方法存在一些局限和安全隐患。

研究表明CD34能突出地显示心组织中较小的和不成熟的微血管或单一的内皮细胞,是血管新生研究的一些局限和安全隐患。

研究表明CD34能突出地显示心组织中较小的和不成熟的微血管或单一的内皮细胞,是血管新生研究的一种可靠的标记物质。本研究采用递增负荷跑台运动训练及低氧作为处理因素,建立大鼠低氧训练模型。用CD34抗体标记心肌组织微血管,探讨低氧训练对大鼠心肌组织血管新生的影响,为**性血管新生疗法提供新的思路和研究途径。

1 材料与方法

1.1 实验对象及分组

健康雄性2.0月龄Sprague-Dawley大鼠60,体重约220 g(由中南大学湘雅医学院动物学部提供)。用标准啮齿类动物饲料喂养,生活期间室温保持2023,相对湿度45%55%,每天光照12 h。适应性喂养1周后,随机分为6组:1对照组(正常大气压下的氧含量)、2高住组(低氧环境下居住)、3常练组(常氧条件下训练)、4低住高练组(常氧条件下居住,低氧条件下训练)5高住低练组(低氧条件下居住,常氧条件下训练)和6高住高练组(低氧条件下居住,低氧、常氧训练交替进行),每组10只。

1.2 运动训练安排常练组大鼠训练方案(速度×持续时间)

星期一星期二星期三星期四星期五星期六第115×2515×2515×2516×2516×2516×25217×2517×2517×2518×2518×2518×25319×3019×3019×3020×3020×3020×30421×3521×3521×3522×3522×3522×35523×4023×4023×4024×4024×4024×40625×4525×4525×4525×4525×4525×45726×4526×4526×4526×4526×4526×45826×5026×5026×5026×5026×5026×50927×5027×5027×5027×5027×5027×501028×5028×5028×5028×5028×5028×50速度:m/min;持续时间:min;跑台坡度:10%1.3 低氧处理

采用美国Hypoxico公司的低氧装置,用美国产TOXIRAEPGM-36型氧气监测仪实时监测低氧舱中氧含量的变化,第1周至第7周低氧程度逐周递增,分别为:1 800 m2 100 m2 400 m2 700 m3 000 m3 300 m3 600 m,第7周后保持3 600 m到第10周,所有高住组大鼠全部在低氧舱中居住。

1.4 实验取材

训练方案结束后,每组随机取4只大鼠,用0.4%****钠1 mL/100 g体重麻醉后,将大鼠呈仰卧位固定于手术台上,暴露胸腔;从主动脉胸部近心端插入细塑料管,扎紧固定,缓慢注入1%肝素2 mL;然后快速滴灌250 mL0.85%的生理盐水,迅速剪断后腔静脉;待生理盐水滴完后,换滴50 mL4%多聚甲醛缓冲盐溶液(0.01 MpH7.4PBS),快速滴完,整个滴灌时间约30 min;取出整心置同一固定液中固定24 h后,将心脏沿房间隔、室间隔所在平面切开,常规脱水、透明、进蜡、石蜡包埋,用于**组织化学标本制作。

1.5 心肌组织CD34**组织化学标本制作

石蜡切片脱蜡至蒸馏水;用0.3%H2O2阻断内源性过氧化物酶,用0.3%TritonX-100处理增加标本通透性,用0.01 molpH6.0的柠檬酸缓冲液微波修复抗原;羊血清(150)处理标本,减少和消除非特异性染色;分别加一抗(1500,兔源CD34单克隆抗体)、二抗(1200)ABC复合物(11100)37恒温箱于湿盒内孵育;用终浓度为0.05%DAB-0.03%H2O2TB显色;镜下控制显色时间,显色时间515 min;苏木精衬染,常规脱水、透明,中性树胶封片。用PBS代替一抗作为空白对照。

1.6 微血管密度的计算方法

按照Weinder报告的方法进行结果判断,用血管数目的平均数来表示。先在低倍镜(×40)下扫描整个视野的区域,选择其中高阳性物质表达密度区,然后在高倍镜(×200)下计数被抗CD34抗体染成棕色的血管数目,每个染成棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇,只要它们和临近的微血管、心肌细胞或其它结缔组织分开,就把它们视为一个微血管。结果用5200倍视野下的血管数目的平均数来表示。

1.7 微血管灰度水平和表达面积的测试 用SimplePCI图象分析系统对**组化阳性产物的灰度和面积进行分析。具体步骤:每张切片在10×40倍镜下选取不相重叠的3个代表性视野,测量阳性产物的面积和灰度值以及所选区域的平均灰度值。

1.8 统计分析

所得数据用SPSS13.0统计软件处理。数据用平均数±标准差表示,各组间显著性差异采用方差分析,组内显著性差异用t检验。显著性水平为α=0.05P<0.05为差别具有显著性,P<0.01为差别具有非常显著性。

2 结 果

2.1 大鼠心肌组织CD34**组织化学观察结果 大鼠心肌组织血管经CD34**组织化学染色呈棕黄色,着色鲜明,血管管腔明显。CD34 的染色定位于血管内皮细胞膜上,呈棕黄色,细胞核呈紫色。微血管的形态不规则,有的新生血管已呈管腔结构,有的只见内皮细胞呈条索状或点状分布。

group)光密度值

optical density)阳性物质表达面积

/um2area)微血管密度个数 /mm2

capillary density161.0 543±2.84 8913 657.045±546.71 4537.1 362±1.04 881263.9 778±3.16 1814 181.702±727.66 9468.2 563±2.16 795382.7 932±3.74 15412 364.528±1474.90 078**25.3 422±3.88 158**495.4 952±4.76 10623 855.051±3 319.40 152**#32.0 342±9.54 289**##5102.5 280±3.31 47024 245.952±3 584.27 104**#32.5 342±9.54 289**##6114.6 824±3.93 07429 267.503±4 701.86 546**##35.6 477±4.80 278**## 注:“*”代表与正常对照组比较,“*”P<0.05“**”P<0.01“#”代表与常氧运动组比较,“#”P<0.05“##”P<0.01

3 分析与讨论

血管新生(angiogenesis)主要是在原有的****与/或微静脉基础上通过血管内皮细胞的增殖和迁移,从先前存在的血管处以芽生或非芽生(或称套迭)的形式生成新的****的过程。影响血管新生的因素有很多,如锻炼、缺血、低氧、肿瘤等一些生理或病理过程,这些过程都能诱发血管的新生。人类生来具有冠状动脉侧支血管,但没有充分的侧支循环。心肌缺血缺氧刺激可以诱导侧支循环的开放和血管新生,改善心肌缺血状态,使冠心病患者得到有效的**,对心肌梗塞后微血管的重建也有积极的意义,但缺氧诱导血管新生的程度与低氧浓度、刺激时间的长短、有无运动介入等因素有关。

3.1 低氧与血管生成 本研究发现,单纯低氧组不能显著促进大鼠心肌组织血管的生成,但是有许多CD34染色不是很深,成丝状的血管样结构,还没有形成功能性的血管。这与某些学者的研究结果不相一致,国内有学者观察大鼠在模拟5 000 m高原低氧5 d15 d30 d后,心肌****、血供和心功能变化。发现:急性低氧5 d时,心肌****未新生,心肌血流量显著增加;随低氧时间的推移,15 d以后,****增生。郑澜等在低氧训练促进心肌组织微血管体视学研究中表明,仅经低氧处理不能增加大鼠心肌组织微血管密度,低氧中****密度的增加是因为肌纤维横断面减少,而不是由于血管新生。Olfert等研究发现长期低氧未能增加****/肌纤维比,****数量也无增加。产生这些矛盾结果的原因可能与受试对象、低氧程度、低氧时间及低氧时的其它环境等因素有关。

研究发现短期的低氧可诱导大鼠心肌VEGF表达升高,从而促进****的生成反应,如延长低氧时间,VEGF表达将受到抑制,降低血管生成反应的发生。这是因为机体内由缺氧引发VEGF发生的这一系统存在负反馈调节机制。随着低氧时间的延长,出现了机体对缺氧的习服,反复的缺氧使VEGF对缺氧不敏感,逐步恢复到基础水平,****不再发生增生。本文研究中低氧试验的时间长达10周,使机体对缺氧产生了习服,因此本文的研究中****的增生不是很明显。

3.2 运动与血管生成 耐力训练在使心肌代谢能力增长的同时,产生血管生成反应。本研究发现运动训练组心肌组织CD34的蛋白表达丰富,较不运动组和低氧组有显著性差别。对递增负荷耐力训练的研究也表明,心肌组织血管床横断面积的增加主要在于小动脉数量和大血管的管径的增加。进一步研究发现,增加的原因是由于在****生成的同时,有一部分****通过动脉化途径转变成动脉,从而掩盖了****的新生这一现象。Tagarakis等的研究认为,运动可使心肌****密度显著增加。大量文献也表明,****在运动中发生了生理性或病理性重塑:适宜的运动负荷导致心肌组织中****数量增多。LeonBloorHE染色用墨汁灌注的方法先后研究了幼年,成年和老年大鼠经游泳训练后心肌毛细血及****与心肌纤维比值(C:F),得出结果:C:F各年龄组增多,提示****增多。较多的研究报道:正常动物在运动条件下VEGFmRNA显著升高,这种条件并不产生明显低氧,说明肌肉收缩时还要其它信号能提高VEGFmRNA。这些信号可由运动中关系血流量的刺激源和/或肌肉运动时负荷导致的机械变化而引起。例如:运动时剪切力的增加可以提高NO水平,而适量的NO可激活VEGF的表达,促进血管新生。机械刺激还可扰乱基底膜中与肝素结合的bFGF,促进VEGF的表达。随着训练时间的延长VEGF对运动的反应削弱,运动诱导的VEGF水平升高可对训练产生适应。

因为本试验常氧训练的方案每个星期采用的都是递增负荷,使运动保持对VEGF的持续刺激,诱导大量的VEGF表达,促进血管的新生。因此本试验结果显示运动训练组有血管新生。

3.3 低氧训练与血管生成 低氧训练使人体承受环境缺氧和负荷缺氧的双重刺激,因此有着比单一训练刺激更高水平的适应。本研究发现,在低氧训练状态下大鼠心肌组织有大量的新生血管生成。这与很多学者的研究结果相吻合:郑澜的研究结果表明低氧运动可使心肌组织以芽生的方式或者非芽生的方式形成新的****,而通过透射电镜可观察到是以非芽生的血管生成方式为主。陈福刁等研究经过4周的每天12 h的海拔4 000 m慢性间歇低氧训练的大鼠,其心肌****产生适应性改变。毛杉杉等观察到急性低氧力竭运动可引起心肌****新生,但属于速发效应。黄丽英等发现每天12 h的海拔4 000 m慢性间歇低氧训练能显著增加心肌组织的微血管。另外研究表明,适度的间歇低氧适应结合运动训练可更好地促进心肌VEGFmRNA的表达,促进心肌血管再生。

同常氧训练一样,随着心肌对低氧运动的适应,VEGFmRNA水平对低氧训练的升高反应减弱。这是因为组织局部缺氧形成的氧梯度,VEGF表达升高的先决条件。一旦这种氧梯度不存在或消失,VEGF就不会表达或是表达上调的VEGF开始下降[19],从而使血管生成反应消失。因本试验低氧训练的方案每个星期采用的都是递增负荷,使机体在前一个星期产生的习服,在下一个星期很快就在新的负荷刺激作用下产生不习服,始终使机体的局部缺氧组织产生氧梯度,因此试验结果表明低氧训练组有着丰富的血管新生。

尽管各低氧训练组能显著促进心肌组织的血管新生,但是各低氧组对心肌组织血管新生的影响程度还是略有不同。从各低氧训练组相互比较来看,高住高练低练在血管生成的效果方面优于其他的低氧训练组,而高住低练和低住高练对血管新生的影响差别不大。这可能是高住低练训练法虽然有利于训练强度和量的提高,但是,却分散了低氧与训练的双重刺激强度。低住高练训练法虽然通过缺氧和训练的双重负荷对机体造成刺激,但由于缺氧暴露时间短,对缺氧刺激时间不足,对机体的刺激强度也不大。而高住高练低练,既让运动员居住低氧环境中,又同时在低氧环境中进行运动训练,加大了低氧与训练对机体的刺激强度,使机体各个系统产生更深刻的代偿性适应,从而使血管生成的效果更显著。研究结果表明高住低练组与低住高练组相比,微血管密度增加不明显,但微血管染色的程度加深。高住高练低练组与高住低练组、低住高练组相比,微血管增加明显(P<0.05),血管开始形成较清晰的圆形。

从以上的分析讨论中我们可以得知,低氧训练能很好地促进心肌组织****的新生,尤其是高住高练低练训练法,血管生成很丰富。因此采用递增负荷跑台运动训练及低氧作为处理因素,建立起来的这种低氧加训练的低氧训练动物模型,能很好地促进心肌组织的血管新生,能为血管的生理性重建提供一个新的研究方法和途径。

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