大鼠急性心肌梗死动物模型的建立和评估

    心肌梗死（myocardial infarction，MI）是21世纪医学亟待解决的难题之一。由于MI的许多病理生理资料难以从临床研究中获得，其防治上的进展有赖于基础研究上的突破。MI动物模型的建立是开展基础研究的步，它对于研究人类MI的病理生理变化、心电生理改变以及评价各种**方法具有重大价值。结扎左前降支制作MI模型，是一个被广泛接受近于成熟的动物实验模型。但随着实验技术的发展，它的一些操作步骤、评价指标等方面仍需进一步改进。本实验在传统方法的基础上作了相应的改进，以SD大鼠为实验对象建立MI动物模型，方法操作简单、模型成功率高、重复性好，为下一步的实验研究奠定了基础。

1 对象与方法

1．1 研究对象 清洁级雄性Spreague-Dawley（SD）大鼠20只，体质量250~300 g（275±15．3）g，由广州中医药大学实验动物中心提供。随机分为假手术组和心肌梗死组。

1．2 研究方法

1．2．1 MI模型的建立***（75 mg/kg）腹腔注射麻醉，经口人工呼吸（导管置于大鼠的舌体与上颌之间），连接小动物呼吸机予以正压通气，潮气量3~5 ml/100 g，呼吸频率60次/min，吸呼比1∶1。左侧胸部备皮，消毒手术区域，经胸骨左缘第4肋间开胸，钝性分离肌肉，以眼科开睑器撑开肋间肌切口，暴露心脏，剪开心包，于肺动脉圆锥与左心耳之间距主动脉根部2~3 mm处，用7-0眼科无创缝合针，穿过前降支深部连同一小束心肌一并结扎。根据心电图和心肌组织颜色确定冠脉结扎成功。逐层缝合胸壁，自主呼吸恢复后拔出通气导管。大鼠清醒后送动物房饲养，规律照明，自由进食和饮水。术后连续3 d予以青霉素40万U腹腔注射以预防感染。假手术对照组除不结扎冠状动脉外，其余步骤相同。

1．2．2 超声心动图检查3%****钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉，用Philips Sonos 5500型多功能超声诊断仪（S12探头，频率5~12 MHz），在胸骨旁以二维超声和M型超声测量左室收缩末径（LVSd）、左室舒张末径（LVDd）、舒张期左室后壁厚度（PWd）、舒张期左室前壁厚度（AWd，MI组为梗死区室壁厚度）、左室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（FS），分别计算梗死区变薄指数（BBZS，即舒张期左室前壁厚度/后壁厚度）和非梗死区增厚指数（ZHZS，即舒张期左室后壁厚度/前壁厚度）。所有参数均在3个连续的心动周期中进行测量并取平均值。

1．2．3 血流动力学检查3%****钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉，气管切开插管，保持呼吸道通畅。分离右侧颈总动脉，插入2F聚乙烯导管，0．3%肝素生理盐水抗凝，将压力传感器与BL-420E生物信号采集与处理系统连接，测量并记录颈总动脉收缩压（SBP）和舒张压（DBP），向前推送导管至左心室测量左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室内压大上升和下降速率（±dp/dtmax）等参数。

1．2．4 组织病理学检查 各项检查完成后，经股静脉注入10%KCl 2 ml，使心脏停搏于舒张期，迅速取出心脏，PBS液洗去血液，滤纸洗净水分后用电子天平（到0．1 mg）分别称取左、右心室实际重量（LVAW、RVAW），计算其与体质量（BW）的比值，得到左、右心室相对重量（LVRW、RVRW）。将心脏从心尖到心底沿长轴横切4等分，4%多聚甲醛固定24 h后分别石蜡包埋。各取一张5 μm的病理切片作HE染色。用HPIAS彩色病理图文分析系统测量每张切片的心内膜缘总长及心梗部位心内膜缘长度，计算梗死面积。组织切片常规Masson染色，随机选取4个不含血管视野，用Image Pro Plus5．0图像分析软件计算胶原容积积分（collagen volume fraction，CVF）。

1．2．5 统计学方法 数据以均值±标准差（x±s）表示，两组间均数的比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 大鼠生存情况 MI组大鼠14只，术中死于心室颤动和心跳呼吸骤停4只，术后1周死亡1只（心力衰竭），存活4周大鼠共9只，存活率为64．3%。6只假手术组大鼠全部存活。

2．2 MI复制成功的证据

2．2．1 大鼠一般情况 冠脉结扎术后大鼠精神萎靡呈蜷缩状、活动较少、呼吸浅促、抓起时反抗较轻，毛发枯槁呈黄白色、多见倒竖，进食量明显减少；同期假手术组大鼠术后1 d即恢复至术前的食欲和运动量，毛发平滑而有光泽。

2．2．2 心电图 冠脉结扎即刻，缝线下方心肌色泽变白，局部心肌运动减弱，心电图提示肢导联R波振幅明显升高，ST段弓背向上抬高0．2 mV以上。2．2．3 心肌组织HE染色 假手术大鼠心肌细胞横纹及闰盘清晰，纤维结构清楚、排列整齐、无炎症细胞浸润；冠脉结扎术后4周非梗死区心肌细胞代偿性肥大，纤维组织增生、排列紊乱、炎症细胞浸润明显，部分心肌细胞肌浆嗜伊红性增强。测量所得MI组大鼠的梗死面积在40%~45%之间（平均42%）。

2．2．4 心肌组织Masson染色 假手术组心肌组织胶原纤维少，无条索状及融合的胶原纤维；MI组左室非梗死区胶原纤维显著增多，呈条索状，分割包绕心肌束、部分胶原纤维融合。

2．3 超声心动图检查 与假手术组比较，MI大鼠LVSd、LVDd和ZHZS明显增加（P<0.01），PWd、AWd、BBZS、LVEDP显著增加（P<0.01）。

2．5 心室重构指标 与假手术组比较，MI大鼠左、右心室实际和相对重量以及CVF均明显增加（P<0.01）。

3 讨论

    MI动物模型的制作有多种方法，各有利弊，也因人而异。早期国外多采用Johns法，即在自主呼吸条件下，不用呼吸机支持，迅速开胸挤出心脏行冠状动脉结扎。这种方法需要在极短的时间内完成操作，技术要求高，难度大，难以掌握；而且由于心脏移位，容易导致血流动力学紊乱和心律失常等并发症；开胸后小动物呼吸无法得到，因而手术死亡率极高。此后Fisbein[9]和Pfeffer[10]在Johns法的基础上略加改进，应用小动物呼吸机维持呼吸，明显提高了手术的成活率。常用的气道建立方法有：气管切开、经口气管插管、经口人工呼吸（导管置于大鼠的舌体与上颌之间）、面罩呼吸等。气管切开法虽然操作容易，但术后呼吸道并发症多，大鼠难以长期存活。经口气管插管相对较难，技巧性大，需要有麻醉插管经验，如果不熟练，一次插管不成功，反复操作刺激大鼠喉部，易使其喉部粘膜水肿，气道分泌物增加，导致气道阻塞甚至窒息死亡。本实验在小动物呼吸机支持下，经口人工呼吸（导管置于大鼠的舌体与上颌之间），操作简便，且可在开胸后为冠状动脉结扎赢得较长时间，术后呼吸道并发症少。经口人工呼吸中，气体经口腔进入胃肠是常见的问题，但不影响动物存活。人工呼吸前采用小腹带绷扎腹部，可明显减少气体进入胃肠。与此同时本实验以眼科开睑器充分撑开肋间肌切口，不但手术视野清晰，易于操作，而且避免心脏移位和血流动力学紊乱，明显减小心脏损伤和心律失常等的发生。准确结扎是MI模型制作成功的关键。本实验以左心耳和肺动脉圆锥为标志，在距主动脉根部2~3 mm处结扎冠状动脉，定位准确，重复性好。熟练后从开胸至缝合整个过程可在1 min内完成，结扎成功率高，术后存活率也高。造模4周后，大鼠心脏左室前壁可见瘢痕组织，超声心动图示梗死区心肌运动减弱，非梗死区心肌、室间膈和右室明显肥厚，左室腔扩张。HE染色和Masson染色示非梗死区纤维组织增生、排列紊乱、伴有大量炎症细胞浸润。血流动力学检查示左室收缩和舒张功能下降。提示MI动物模型建立成功。试验中MI组各大鼠的梗死面积在40%~45%之间（平均42%）），表明实验均一性良好。

    MI模型制备过程中存在麻醉、气道建立、呼吸机参数调节、冠状动脉结扎等易导致造模失败或大鼠死亡的因素。为了提高模型制造的成功率及大鼠的存活率，本实验注意做到以下几点，供读者参考：①严格称重，准确计算***量；②术中良好的人工呼吸；③正确选择开胸位置，以眼科开睑器充分暴露胸腔，使手术视野清晰；④结扎部位准确，进针深度适当；⑤术中避免肺损伤，术后恢复胸腔负压；⑥尽量缩短手术时间；⑦良好的术后保暖和护理；⑧术后严密观察及时处理严重的心律失常。