血虚证动物模型研究概况(上)

常用的有以下几种。

1 失血性血虚证动物模型

本类模型多为急性失血性血虚证,一般采用放血法制备。失血法可有效降低外周血中全血细胞数量,但放血量难以控制,模型间有较大差别。一般制备方法:小鼠,体重20～22g,尾部放血0.5ml/只,失血后24h左右即可;大鼠,体重180～200g,尾部放血1.5～2ml/只,隔日1次,连续5次;犬按40ml/kg体重放血,反复几次即可造成失血性血虚证动物模型。王平等采用耳静脉放血法建立了家兔血虚证模型,并从免疫学、血液流变学、红细胞膜酶、红细胞变形性、微量元素等方面对该模型进行了研究。

,多采用放血的同时结合其他方法制备血虚证动物模型。欧敏等采用放血加适当限食方法制备家兔血虚证模型。每次由兔耳中间动脉、静脉及耳缘静脉放血,放血量为全身血容量的10%,隔日1次,共7次。自造模之日起,家兔改为半量喂养。制成的血虚证家兔外观体征:精神萎靡、倦卧少动、毛枯蓬松、拱背消瘦、唇色淡白、睑结膜苍白、食欲下降、体重减轻、外周血红细胞计数及血红蛋白含量显著降低、超氧化物歧化酶活性显著降低、过氧化脂质含量显著增加、红细胞变形性显著降低。桂蜀华等采用每日小鼠尾部放血25滴,同时配合喂养低营养精面粉。通过对血红蛋白的动态监测,证实第3周小鼠血红蛋白显著降低,停止放血后,继续喂精面粉7d,血红蛋白维持在原有水平不再回升,给予**中药复方后小鼠外周血血红蛋白及红细胞量显著回升。梁毅等采用慢性放血配合饥饿、疲劳法,制作出复合血虚证小鼠模型。具体方法:①放血。由眼眶后静脉丛放血6～8滴(约0.5ml),隔日1次,直至模型成功。②控制饮食。自造模之日起改变其正常饮食量,控制在每日50g/kg体重,自由饮水。③劳倦。小鼠每天在温水池中强迫游泳2次,每次游泳时间不定,以即将下沉为限,持续15～20d。一般在造模第15天起显现血虚证症状体征:精神萎靡、毛色枯黄蓬松、眼唇鼻苍白无华、鼠尾色淡且血管难以辨认、体重明显减轻等。血液细胞学检测主要表现为红细胞计数明显下降,白细胞、血小板则无明显改变;胸腺指数下降,骨髓有核细胞计数显著增多,体外培养骨髓造血祖细胞CFU-E、BFU-E和CFU-GM显著减少。研究表明,中药复方对综合放血制备的血虚证小鼠模型有良好的**效果。

2 化学损伤性血虚证动物模型

贲长恩等[9]于1977年采用具有溶血作用的乙酰苯肼(APH)制备血虚证动物模型。乙酰苯肼是一种强氧化剂,对红细胞(RBC)有缓慢的进行性氧化损伤作用,突出表现在干扰RBC内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD),使RBC易于崩解而出现溶血性贫血,使RBC和血红蛋白(Hb)明显减少、网织RBC(rRBC)代偿性增多,肝脾肿大。由于RBC破坏、减少而引起严重缺氧,导致肌肤、黏膜、毛发及脏器失养,出现中医血虚证表现。制备方法:选用Wistar大鼠,皮下注射2%APH生理盐水溶液,剂量为10ml/kg体重。实验分一次性给药和实验1、4、7天3次给药两种,后者第2、3次给药剂量减半。**中药可防治和逆转由APH所致血虚证[10]。

另一种常用药物是环磷酰胺(CTX)。CTX是细胞毒制剂,其作用机制是抑制骨髓功能,使造血细胞生成减少。此种造模方法简单易行,用量及时间可灵活掌握。但其对红细胞作用不如对白细胞明显,且持续时间较短,如果受试药物显效较慢,模型动物血象即自然恢复,甚至出现反跳现象[11]。小鼠以CTX100mg/kg体重腹腔注射1次,4d后即使外周血白细胞数明显下降。大鼠以CTX灌胃,次60mg/kg体重,1周后改用20mg/kg体重,3～4d1次,共2次;用30mg/kg体重,3～4d1次,共2次;大鼠以CTX静脉注射,周10mg/kg体重,给药2次,**周15mg/kg体重,给药1次,均可形成白细胞减少模型。

为研究CTX诱发的小鼠血虚证变化特点,马增春用不同剂量CTX分别进行腹腔注射制备小鼠血虚证模型,动态检测血虚证小鼠外周血象、CD34+细胞在骨髓有核细胞中的比例和骨髓细胞周期改变。在造血组织中,CD34表达高的是早期造血祖细胞,随着细胞分化成熟而逐渐减弱直至消失,CD34+造血细胞包含造血干细胞和造血祖细胞[14]。小鼠骨髓中CD34+细胞的比例可反映骨髓中造血干/祖细胞的数量。结果表明:用CTX分别按100mg/kg、200mg/kg、250mg/kg体重剂量给小鼠一次腹腔注射,均可使外周血白细胞在注射给药后3d降至低,且白细胞降至低点水平与用药剂量呈负相关,白细胞在给药后5d开始回升,给药后7d超越用药前水平,此后缓慢下降。CTX对外周血血小板有相似影响,但在用药后5d降至低,10d超越用药前水平。250mg/kg体重组小鼠骨髓中CD34+细胞在骨髓有核细胞中的比例先下降后上升,在第3天达高峰值,随后下降;100mg/kg体重组CD34+细胞在骨髓有核细胞中的比例先升高,第5天达高峰值,随后下降。250mg/kg体重组小鼠给药后1d,用亚二倍体峰检测骨髓凋亡细胞率为6.53%±2.66%,用DNA凝胶电泳可检测到DNA梯状带,两项指标均表明CTX在用药后1d可诱导骨髓细胞凋亡。250mg/kg体重组小鼠骨髓中G2/M期细胞在给药后第3天达到高峰,S期细胞在给药后第5天达到高峰;100mg/kg体重组小鼠骨髓细胞周期有相似规律,但G2/M期和S期细胞的达峰时间延迟。CTX可以动员骨髓造血干祖细胞进入细胞周期而增殖,增加了骨髓造血干祖细胞的数量,但此过程加速了干祖细胞池的耗竭,从而对骨髓造成更大损伤,这可能是CTX诱发小鼠血虚证的机制之一。**方剂可显著促进该血虚证模型小鼠外周血白细胞数量的恢复,提高骨髓中CD34+细胞的比例,并促进骨髓细胞由G0或G1期进入S期。蒲春霞等给小鼠腹腔注射CTX100mg/kg体重,每日1次,连续3d,制备血虚证模型。结果显示,模型小鼠外周血白细胞和血小板显著降低,脾结节生成单位和粒系-巨噬系集落生成单位显著降低。而**方剂可显著逆转上述变化。谭洪玲等采用腹腔注射CTX250mg/kg体重,造模后第10天进行骨髓集落细胞培养,同时检测CD34+细胞。结果表明:模型对照组小鼠骨髓中的CFU-GM、CFU-E、BFU-E、D34+细胞比例显著减少。**方剂可显著逆转上述改变。

,化学损伤模型还采用APH与CTX联合使用的复合血虚证模型。此种造模方法从双重环节上造成动物血虚,表现为骨髓超微结构发生变化,造血微环境遭到破坏,骨髓造血重建活性下降,骨髓有核细胞数量及其增殖速度下降,从而导致各类细胞数量下降。采用此方法造模,模型动物存活率较高,血虚状态的持续时间相对较长。金若敏等采用该方法造模:小鼠分别于1天、第4天皮下注射APH20mg/kg、40mg/kg体重,从第4天起,每日腹腔注射CTX40mg/kg体重,连续4d。模型小鼠在注射后第4天即出现行动迟缓,团缩拱背,喘促,面、眼、耳、尾苍白而凉,毛蓬竖而少光泽,血色暗红。小鼠体温显著降低,游泳时间缩短。于末次给药1.5h后观察小鼠各项指标,结果显示,模型小鼠外周血红细胞、白细胞数量显著减少,网织红细胞比例显著升高,骨髓有核细胞数显著减少,血浆cAMP/cGMP比值降低。**中药能减轻骨髓细胞超微结构的损伤,显著增加血虚证模型小鼠红细胞、白细胞数,降低网织红细胞在外周血红细胞中过高的比例。王燕平等用此方法造模观察到模型小鼠的免疫功能低下,主要表现为T**细胞增殖能力下降。而中药可使其回升。袁久荣等于造模1天和第4天分别给予小鼠CTX60mg/kg体重,第4天和第7天分别给予APH0.1mg/kg体重制备血虚证模型,造模后第5天,小鼠出现懒动、竖毛、少食、体重下降、尾色苍白晦暗等现象。造模后第11天模型小鼠外周血红细胞计数、血红蛋白量、白细胞数等均显著降低。给予**中**剂的小鼠各项指标均显著高于模型小鼠。