DNA测序中常见的模板特异性问题和解决方法

DNA测序是一种多步骤的复杂过程,是重组DNA技术的前提,测序结果结合计算机分析是获得限制性酶谱常用、快捷的方法。对于获得的未知片段,只有了解了核苷酸顺序才能进行下一步实验操作,而且有可能利用生物信息学方法由序列本身推测其功能。DNA测序也是突变检测为直接、可靠的方法。

广泛应用的DNA测序方法有酶促双脱氧法和化学法。前者是利用DNA聚合酶来合成一种标记的与DNA模板互补的链来进行测序;后者是以标记的DNA链在一系列碱基特异性化学试剂作用下来完成测序工作。一般来说,以上两种方法测序结果较为可靠,且重复性好,但在DNA测序中也常常存在一些问题,可影响测序效能和结果的准确性及重复性。

测序中常见的模板特异性问题和解决方法

无论手工测序还是测序仪自动测序,都存在下列问题。

1 测序结果信号弱,无法正常读取序列

常见原因:模板量不足,测序模板量主要取决于模板长度和种类。若为PCR产物测序,一般要求100ng/kb,而质粒DNA可稍多,为100～200ng/kb。

对策:按照要求准确加入所需模板量,具体操作如下:对测序模板进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(敏感度高于琼脂糖凝胶),同时加入定量Marker来判断模板浓度,可粗略目测或应用凝胶自动分析仪中的Gelworks1DAdvanced软件进行定量分析;也可用紫外分光光度计分别测量OD260和OD280测定模板DNA的浓度和纯度。2种方法中的一种都可能受外界因素影响,所以2种方法联用更为科学。

2 测序信号模糊,信噪比显著升高

常见原因:模板DNA污染,可能是PEG,EDTA,RNA或其他DNA导致酶活性受抑制。

对策:对测序模板进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,观察模板DNA是否为单一条带,若条带为非单一,可以低熔点琼脂糖凝胶回收并用专用试剂盒纯化,注意纯化后要进行电泳检测。

3 测序信号提前共同终止,测序反应无法继续进行

常见原因:模板DNA中有二级结构形成[3]、dNTP浓度不当或模板浓度过大,导致测序反应提前终止。

对策:一般商售试剂盒中配套试剂很少出现问题,若为自制试剂,可予替换或重新配制,再重复实验。由于测序反应要求模板为单链,所以对于二级结构形成导致的测序反应共同终止,可以提高模板变性温度使之充分分解为单链,或加入甲酰胺使模板变性充分、。

4 无正常测序信号

常见原因:引物设计不当或模板G2C含量过高。对策:测序引物通常分为通用引物和特异性引物。前者是针对不同克隆载体设计的引物,一般不会存在上述问题。特异性引物是指与模板特异性且性结合的引物,设计原则如下:(1)引物长度≥18bp,一般20～25bp;(2)G2C含量≥50%,一般为50%～60%;(3)避免引物自身形成互补;(4)3′末端为G或C更为合理。模板G2C含量过高者可采用专门为高G2C含量模板设计的测序试剂盒。靠近引物的区域,其测序信号可能由于引物峰遮盖而无法阅读,是测序的难点。可以尝试加入Mn2+(100mmol/LMnCl21μl),可部分解决问题。

测序反应可能存在局部的误差或错误,因此,需要对测序样品进行双向测序,尤其是在突变检测中,要慎重,对于阳性病例,除了常规的双向测序外,还要重复测序以使结果更为可靠。

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