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蛋白质相互作用研究方法之生物物理学方法

在所有生命活动中,蛋白质之间的相互作用是必不可少的,它是促进细胞进行一切活动的基础,以下分享的是蛋白质相互作用研究方法中的其中一种方法-生物物理学方法。

1.  融合蛋白pull-down实验

融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时,可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附,而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。

被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。为了更有效地利用pull-down技术,可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达,即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase ,GST)融合标签从**中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了的推广。

GST融合蛋白在经过固定有GST(glutathione)的色谱柱时,就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱,就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说,GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面:一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质;二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。

该方法比较简便,避免了使用同位素等危险物质,在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。类似的融合蛋白很多,如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化;与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+的色谱柱进行纯化;与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲喋呤的色谱柱进行纯化等等。

2.  亲和印迹

亲和印迹是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了的“诱饵”蛋白发生作用。此方法所要考虑的是如何保持膜上蛋白的生物活性,如何得到纯化的“诱饵”蛋白等。

3.  **共沉淀

如果在非变性的条件下裂解细胞,蛋白质之间的相互作用还可以保持,所以就可利用**共沉淀方法找出相互作用的蛋白质。这其中的例子包括Harlow等。

利用抗体沉淀腺病毒的EIA蛋白时发现了真核细胞中有与EIA蛋白特异结合的蛋白质;McMahon等利用该方法确定了转录结构域相关蛋白质可以与E2F1和c-Myc转录因子相互作用的蛋白质。

**共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用,也可以找出未知的蛋白质相互作用,不管是两者的哪个,其原则都是一样的,都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合,之后通过蛋白质A或蛋白质G-琼脂糖微珠将复合物沉淀下来,然后用SDS-PAGE鉴定。

**共沉淀中设置正确的对照非常重要,因为该方法可能出现假阳性的概率比较高,设置的对照包括:在对照组中使用对照抗体,以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。

4.  荧光共振能量转移技术

荧光共振能量转移技术的原理是:处于激活状态的供体,可以将其本身的荧光传递到与之十分邻近(通常在10 nm 之内)的受体上。因此,如果用遗传突变的绿色荧光蛋白(GFP)或是合成的荧光染料标记蛋白质,则可以通过荧光体之间的能量传递来确定两蛋白质的相互作用。

这种方法较之上述的方法有两个优点:

(1)蛋白质之间的相互作用是发生在完整细胞里,比较完整地反映了蛋白质在生理状态的活动。

(2)利用这种方法,可以观察到蛋白质在细胞内的定位。

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