用端粒酶诱导人类间充质干细胞永生化实验

端粒酶对染色体的稳定性及决定细胞生命周期起极其重要的作用。端粒酶或末端转移酶是由两个主要的亚单位构成：RNA成分（hTR）和蛋白质分解亚单位（hTERT）,RNA（hTR）亚单位普遍表达于正常和肿瘤组织中，而蛋白质分解亚单位（hTERT）仅在肿瘤细胞、生殖谱系细胞及激活的**细胞中表达。

实验步骤     

材料

无菌

生长培养基：含高浓度葡萄糖（4.5 g/L）的 Dulbecco's modifiled Eagle's 培养液（DMEM），添加L-谷酰胺 2 mmol/L、10% 胎牛血清、100U/mL 青霉素及 100 μg/mL 链霉素

聚凝胺： 8 mg/mL

普通容器 ：培养瓶 25 cm2，75 cm2

反转录酶病毒载体的产生用材料

细胞系:

PG13

GP+E-86

反转录病毒载体 GCsam hTERT

转染用 htrt DNA

Tx 缓冲液 ：总量 20 mL，含有以下物质：

HEPES 0.5mol/L，pH 7.1   200μL

NaCl，5rnol/L   100μL

Na2 HPO4/NaH2PO4，1mol/L   3μL

UPW   1.7 mL

缓冲液 A：总量 20.04 mL，含有以下物质：

NaCl（5mol/L）   600μL

EDTA（0.5mol/L）40μL

Tris-HCl，pH7.5（0.5mol/L）400μL

UPW   19 mL

hMSC（人间充质干细胞）细胞的转导用材料

hMSC（人间充质干细胞）细胞

培养瓶 75 cm2

多孔板 6 孔

转导后用材料

用于冷冻保存的实验材料（见方案 20.1）

用于 DNA 指纹分析 (见方案 16.8) 或 DNA 图谱分析（见方案 16.9）或其他验证分析方法的实验材料（如方案 16.10）

PCR 试剂

DNA 100 μg/mL

10×PCR 缓冲液 L（含 Mg2+）

正向引物（2μmol/L）

反义引物（2μmol/L）

dNTP 混合物（10 mmol/L）

DNA 聚合酶

UPW

操作步骤

反转录酶病毒载体的产生

具有 hTERT 基因的反转录酶病毒载体通过两个步骤包装进入长臂猿白血病病毒（GALV）包装的细胞系PG13。，使用 20 μg/mL htrtDNA（Geron）转染包装细胞系 GP+E-86，然后用上清液感染 PG13细胞。

1. 6.7×105 GP+E-86 细胞系接种在一个小培养瓶（25 cm2）中。

2.GP+E-86 细胞系的转染

（a）将 280μL Tx 缓冲液加人每个管中（常用容器）。

（b）制备 DNA 管

（c）将 Tx 缓冲液逐滴加人含有 DNA 溶液的管内，轻轻地混合。

（d）在室温下孵育 30℃，使其产生沉淀。

（e）在每个含有 GP-E-86 细胞的 25 cm2 培养瓶中，加入 5 mL 新鲜培养液。

（f）轻轻加入混合液（Tx+DNA）至 GP+E-86 细胞，在 37℃ 孵育 4-6 h。

（g）在 25 cm2 培养瓶内，用 D-PBSA 小心地洗三次。

（h）加新鲜培养液至细胞中，在 37℃ 孵育隔夜。

3. 更换细胞培养液，加 2 mL 新鲜培养液 (取代以前 5 mL 培养液)，以产生病毒。

4. 在进行第三步的同**，将 1×104 个 PG13 细胞接种于 6 孔板的每个孔中。

5. 次日，从感染的 GP-E-86 细胞收获其上清液，加入终浓度为 8 μg/mL 的多聚胺 (如 1 μg/mL 上清液)。

6. 用孔径 0.45μm 滤膜过滤上清液，将 2 mL 过滤液加至含 GP-E-86 细胞的每个孔中。

7. 在 32℃ 1000 g 离心培养板。

8. 在 37℃ 孵育隔夜。

9. 次日，更换细胞的培养液。

hMSC 细胞的转导

1. 将 2×106 PG13 细胞种人 75 cm2 培养瓶中。

2. 次日，将 6 mL 新鲜培养液加至 PG13 细胞中。

3. 第三日，将 hMSC 细胞（约 2.5×104~7.5×104 个）加至 6 孔板中，用于转导。

4. 从包装的细胞收获上清液，加入终浓度为 8 μg/mL 的多聚胺，用孔径 0.45μm 的滤膜过滤上清液。

5. 将2mL过滤后的反转录病毒上清液加入 6 孔板的每个孔中。

6. 在32℃ 1000 g 离心培养板，37℃ 孵育隔夜。

7. 吸去逆转录病毒上清液，加入新鲜培养基。

转导后培养物的处理

1. 经过10~12次传代接种，未接受hTERT基因的细胞将死亡，剩余的细胞 则已插入hTERT基因，具有hTERT基因的细胞将在传代过程中被选择出来。

2. 建议将细胞分装在安瓿中冷冻保存，建立一个转导细胞的贮备库，这些转导细胞处于不同的群体倍增（PI）水平（可与 PD 生长曲线相匹配）。这样做也可节省时间，因为如果发生污染就要丢弃培养的细胞，重新开始。

3. 在梅次传代培养时，用下列公式获得PD，以建立PD生长曲线。

公式中的PD代表种群倍增的次数，In 是自然对数 Nstart 是细胞初始接种量，Nfinish 是细胞在传代培养过程中所获得的全部细胞数。

例 1，如果初种入2×105个细胞，培养后增加至3.2×106个细胞，则：

如果按 1:4 的细胞量进行传代培养，则每次传代培养后的 Nfinish 将乘以 4。所以在上述例子中，假设有 10 次传代培养，Nfinish 就是（3.2×106）×4 的 10 倍，也就是 3.4×1012。

例 2，如果初种入2×105个细胞，培养后可增加至3.2×106个细胞。以1:4的细胞址传代培养10次，则：

4. 在建立永生细胞系之后，检查其真实性，以其来源于初的材料， 而不是由于交叉污染从实验室其他永生细胞系衍生而来。这是能做到的，例如针对转移基因（hTERT）的PCR 检测、DNA 指纹检 测或 DNA 图谱检测。

hTERT的PCR

1. 溶解PCR试剂并保存在冰块中

2. 对下列试剂进行仔细的混合，记住，要包括阳性对照（其他hTERT阳性标本）和阴性对照（无DNA模板）

DNA1μL（100ng）100μg/mL

10×PCR缓冲液（含 Mg2+）2μL

正义引物   2μL

反义引物   2μL

dNTP 混合物（10 mmol/L）   0.4μL

DNA 多聚酶   0.1μL

UPW   12.5μL

终体积为 20 mL（包括 DNA）

3.将管子置于PCR仪器中，按以下步骤进行操作：90℃，3 min，进行变性作用；94℃，30s，再次进行变性作用；59℃，39s，进行复性；74℃，1 min，进行延伸；如此循环30个周期，然后是74℃，1 min。

4. 将PCR产物在1.5%~2%琼脂糖凝胶中进行电泳。