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Western blot 实验中常见问题及解决方法
一、SDS-PAGE电泳过程
问题1. SDS-PAGE电泳过程中凝胶漏液或凝胶面不平
应对措施：
1）玻璃板洗刷干净
2）加入的AP和TEMED的量要准确
3）凝胶混合液配好后要充分混匀
4）控制电压或采取措施（冰上，冰箱）凝胶温度一致
5）玻璃板底部对齐
6）架子要夹紧，防止漏胶造成胶面不平
问题2. 条带比正常的窄？条带向上弯或向下弯？
应对措施：
1）凝胶聚合不均匀，灌胶时尽量混合均匀，动作轻缓
2）拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲
3）样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度
4）胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适
5）每个加样孔体积应一致，防止由于体积不同导致不同孔之间的挤压
二、转膜及抗体检测过程
问题1. 凝胶肿胀或卷曲？
应对措施：可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min
问题2. 条带歪斜或漂移？
应对措施：电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸
问题3. 单个或多个白点？
应对措施：膜和胶块之间没有气泡
问题4. 转膜缓冲液过热？
应对措施：缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温
三、转移到膜上的蛋白很少
原因1. 蛋白分子量<10KD
应对措施：蛋白分子量<10KD时，减少转膜时间，使用小孔径的膜
原因2. 蛋白分子量过大
应对措施：增加转膜时间，过程中注意保持低温
原因3. 蛋白的等电点<9
应对措施：更换高PH值Buffer
原因4. SDS浓度不合适
应对措施：转移缓冲液加入终浓度0.1% SDS，也是为了增加转移效率
原因5. 凝胶太厚
应对措施：延长转膜时间，过程中注意保持低温
原因6. 转膜效率低
应对措施：
1）转移缓冲液中加入20%甲醇（终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间
2）用上等的转移膜
