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免疫共沉淀(CO-IP)与免疫沉淀(IP)的比较
免疫共沉淀(CO-IP)与免疫沉淀的比较
免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术,其基本原理是,在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA),若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白体—SPA\|Pansobin”,因为SPA\|Pansobin比较大,这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法,用抗体检测目的蛋白是什么,是否为预测蛋白。
这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的,符合体内实际情况,得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷:一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;二是在实验前预测目的蛋白是什么,以选择后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。
免疫沉淀反应主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下,按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验,环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。
免疫共沉淀的优点:
(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;
(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;
(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点:
(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;
(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;
(3)在实验前预测目的蛋白是什么,以选择后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。
(4)灵敏度没有亲和色谱高。
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