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Tunel显色法细胞凋亡检测实验
Tunel显色法细胞凋亡检测实验
实验背景及原理：
细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在生物体进化、内环境的稳定以及系统发育中发挥着重要的作用。细胞在发生凋亡时，会在生理生化和细胞形态上发生一系列变化，在凋亡中晚期，激活的DNA内切酶会切断核小体间的基因组DNA，DNA会被降解成为约180bp-200bp 的片段，而正常或者增殖细胞很少发生DNA断裂。利用这个差异，用脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT 酶）把Biotin标记的dUTP标记到断裂DNA片段的3’-OH 末端，用POD检测标记并用底物显色，然后进行显微镜观察，这个方法被称为TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法细胞凋亡检测。
应用：（1）可用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究；
（2）可应用于临床诊疗，新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及从促凋亡角度探索肿瘤的基因**；
（3）对相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价具有举足轻重的地位。
TUNEL检测法的优势：
TUNEL法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
样本类型：石蜡包埋组织切片、组织冰冻切片、细胞涂片以及贴壁细胞
注意事项：为了避免试剂损失，使用前可以低速短暂离心融化后的试剂，然后小心开管取用；
试剂盒使用后尽快放回-20℃冰箱保存；
TUNEL反应液即用即配，不能配制好后存放；
TdT 酶在-20℃保存时不会凝固，不需要提前取出融化，只需在使用前迅速从-20℃冰箱中拿出取用后立即放回-20℃保 存；
POD反应液用POD贮液和POD稀释液即用即配，配制好后可以4℃保存（3个月），POD可以-20℃保存；
标记反应混合液包含二甲胂酸钾（potassium cacodylate），避免接触皮肤和眼睛，操作时戴好手套；
如果用于石蜡切片的检测，需用蛋白酶K，二甲苯处理；
在标记反应中，推荐使用盖片或封口膜覆盖样本，反应液均匀分布，并避免孵育过程中缓冲液蒸发损失。准备覆盖 膜时，可剪下一片Parafilm®封口膜，使其稍大于样本，并将一角折起便于在接下来实验步骤中取放；
用塑料或玻璃容器及纸巾自制湿盒，在样本处理过程中使用湿盒保持样本环境的湿润，避免样本干燥；
固定样品，需自备多聚甲醛；
悬浮细胞可用以下方法固定或贴附在玻片上：4°C缓慢离心（1000rpm）5分钟，去除细胞培养上清，并将细胞重新悬浮 在4%的甲醛溶液（溶于1×PBS 溶液）使其终密度为1×106/ml，室温孵育10 分钟。按照上述方法离心收集细胞，去除 固定液并用80%乙醇溶液以相同细胞密度重悬。固定后的细胞可以保存在4°C。固定后的细胞（100-300μl）可直接固 定在玻片上，使用聚L-赖氨酸包被的玻片可以提高细胞的黏附性。
