智启医学新维度
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Western blot简略实验步骤
材料：
1 PVDF膜为millipore公司,孔径为0.45um.,
2 过硫酸铵等试剂购自上海生工生物技术有限公司。
3 蛋白预染Marker购自碧云天公司。
4 显影粉，定影粉及X光胶片购自上海冠龙。
5，RIPA缓冲液含50mM Tris (pH7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，0.1% SDS，sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin (碧云天公司)，用时添加PMSF，终浓度为1mM。
6，电泳缓冲液及丙烯酰胺（29：1）均购自上海迪生生物技术有限公司。其它试剂购自上海生工生物技术有限公司。
7，电泳仪，型号 mini protean 3 cell. BIO－RAD 公司。
8, 电转仪，PS-9，大连竞迈科技有限公司。
9，发光剂，ECLTM western bloting detection.，购自GE healthcare, 货号RPN2106
目的蛋白抗体名称
操作流程：
1 电泳：凝胶为12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白的每孔的上样量为40ug总蛋白。电压100V， 15min；120V恒压，1h 30min。
2 转膜：半干转，1h30min。 电转液为1L溶液含3.0g Tris，14.4g 甘氨酸，200ml 甲醇。
3 洗膜：PBS，洗涤5min，一次。
4 加一抗，稀释液为含5％脱脂奶粉的PBST，稀释1：400。4℃,一抗室温孵育2h。
5 洗膜，PBST洗涤3次，每次5min。
6 加二抗，抗兔HRP二抗，稀释液为含5％脱脂奶粉的PBST，稀释1：5000，室温摇晃2h。
7 洗膜，PBST洗涤3次，每次5min。
8 发光： 加发光剂，X光胶片曝光，压片约1min，显影。
β-actin（内参蛋白）
操作流程：
1 电泳：凝胶为12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，浆蛋白的每孔的上样量为40ug总蛋白。电压100V， 15min；120V恒压，1h 30min。
2 转膜：半干转，1h30min。 电转液为1L溶液含3.0g Tris，14.4g 甘氨酸，200ml 甲醇。
3 洗膜：PBS，洗涤5min，一次。
4 加一抗，β-actin（abcam），稀释液为含5％脱脂奶粉的PBST，稀释1：10000。4℃, 一抗室温孵育2h。
5 洗膜，PBST洗涤3次，每次5min。
6 加二抗，抗鼠HRP二抗，稀释液为含5％脱脂奶粉的PBST，稀释1：5000，室温摇晃2h。
7 洗膜，PBST洗涤3次，每次5min。
8 发光： 加发光剂，X光胶片曝光，压片约30s，显影。
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