产品名称：KO first小鼠模型

一、技术原理与核心设计

1. ‌多用途模块化设计‌

   • ‌三位一体功能‌：通过单次构建实现传统KO、条件性KO（CKO）和报告基因过表达三种模式切换。
   • ‌核心元件‌：
     • ‌基因陷阱模块‌：5'UTR插入SA-βgeo（剪接受体-β半乳糖苷酶融合基因），实现组成型基因沉默。
     • ‌条件性模块‌：关键外显子（如第2-4号）两侧插入loxP位点，支持Cre介导的组织特异性敲除。
     • ‌筛选标记‌：FRT-flanked NeoR（新霉素抗性基因），用于ES细胞阳性克隆筛选，后续可通过Flp重组酶切除。

2. ‌技术优势‌

   • ‌灵活性‌：同一模型可满足不同研究阶段需求，避免重复构建。
   • ‌效率提升‌：整合报告基因（如LacZ或荧光蛋白）便于表达谱分析。

二、构建流程（以ES细胞同源重组为例）

1. ‌靶向载体设计‌

   • 同源臂长度：5'和3'臂各1.5-3 kb，确保重组效率。
   • 关键外显子选择：避开头个外显子（防止启动子破坏），通常靶向第2-4号外显子。

2. ‌ES细胞编辑与验证‌

   • ‌电转与筛选‌：线性化载体电转至JM8A3.N1等ES细胞，G418筛选7-10天。
   • ‌克隆鉴定‌：
     • 5'端PCR（同源臂外侧引物+βgeo内引物）。
     • Southern blot确认单拷贝整合23。

3. ‌小鼠繁育与模型切换‌

   • ‌F1代‌：嵌合体小鼠与野生型交配，获得SA-βgeo-loxP-Exon2-loxP-NeoR+后代。
   • ‌NeoR切除‌：F1代与Flp deleter小鼠交配，生成仅含SA-βgeo和loxP的"clean" KO-first小鼠。
   • ‌条件性敲除‌：与组织特异性Cre小鼠杂交，实现靶向基因敲除36。

三、应用场景与典型案例

1. ‌基因功能多维度研究‌

   • ‌传统KO模式‌：通过SA-βgeo阻断基因转录，研究全身性功能缺失表型。
   • ‌条件性KO模式‌：如肝脏特异性敲除代谢相关基因研究非酒精性脂肪肝。

2. ‌报告基因应用‌

   • β-galactosidase（βgeo）表达可追踪内源基因表达谱。

3. ‌胚胎致死基因研究‌

   • 避免传统KO导致的发育缺陷，通过时空特异性敲除解析基因在成体中的作用。

四、技术挑战与优化方向

1. ‌脱靶风险控制‌

   • CRISPR-Cas9需优化gRNA设计，ES打靶需严格验证同源重组效率。

2. ‌繁育周期优化‌

   • 传统ES打靶需7-12个月，CRISPR辅助构建可缩短至6-9个月。

3. ‌伦理合规性‌

   • 遵循"3R原则"，优先使用现有资源库模型（如南模生物6000+成品小鼠）