实验原理

油红O是很强的脂溶剂和染脂剂，较易与甘油三脂结合呈小脂滴状，与磷脂结合力稍差。

染色原理：主要通过物理上的溶液作用或吸附作用，借溶液作用使脂肪染色。染料在冰冻切片内脂质的溶解度较在原溶剂中的溶解度更大，所以在染色时染料就从有机溶剂转移入脂质而使脂肪染色。

油红O染色方法可用于检测组织或细胞中脂肪油滴的存在和数量，尤其适用于脂质代谢疾病的研究。

实验指南

样本准备：选择细胞或组织样本。确保样本是新鲜的，保存在冰箱或液氮中。

样本固定：用4％的多聚甲醛或其他合适的固定行固定样本，保证固定剂浓度充足并确保完全固定。

化学处理：将固定的标本进行化学处理，以去除其内部的脂质和其他物质。常用方法是将样本用80％的乙醇浸泡。

染色：在油红O染色液中将标本浸泡，时间可以根据需要自行决定。将标本移入去离子水或其他适合的缓冲液中冲洗，使其达到理想的染色效果。

显微镜检查：将标本放在显微镜下检查。您应该能够看到样本中的脂肪油滴，它们应该呈现出红色。

油红O染色应用

1. 显示组织内的脂肪。

2. 动脉粥样硬化（AS）动物模型评价：AS模型主动脉整体油红O染色评价，油红O染色不仅可以有效直观地反应整根主动脉的AS病变程度,而且可以评价血管局部不同部位AS斑块的病变情况。

3. 脊髓损伤动物模型评价：油红O染色能够较明显的区分白质及灰质，在一定程度上反映了白质的完整程度。断端坏死灶内油红0染色随脊髓损伤时间的延长逐渐明显，能够反映脂质在脊髓损伤过程中起着重要作用。

油红O染色操作：

① 冰冻切片厚度6～10µm，不固定或10%福尔马林固定10min后水洗。

② 切片入蒸馏水中稍冲洗3道；切片入60%的乙醇内浸洗20～30s。

③ 切片入油红O染色液中（油红O储备液与双蒸水为3：2混合后，装入洁净EP管静置10min），加盖密闭染色10～15min，该过程注意避光。

④ 分色：入60%的乙醇内稍洗以便去除染液。入蒸馏水中清洗3次。

⑤ Mayer苏木素染色液复染核1～2min。

⑥ 1%的盐酸溶液稍微分化一下。

⑦ 自来水漂洗10min或稀碳酸锂溶液中促蓝。

⑧ 将切片放于60℃烘箱中进行干燥。

⑨ 甘油明胶或阿拉伯糖胶封固。

⑩ 采图。（染色结果不能长期保存，应尽快观察及照相）

针式滤膜过滤器油红O染色法

① 常规冷冻切片将高脂小鼠肝脏样本切片6～8µm厚，贴于载玻片。

② 固定：置于10％中性福尔马林固定3min，双蒸水清洗。

③ 取油红O储备液与双蒸水为1：1混合，装入洁净EP管内备用。

④ 将切片从水中取出沥水后平铺于湿盒内，注意不要干片。

⑤ 用注射器吸取配制好的油红O染液，由针式滤膜过滤器(0．22斗m)上端接口处注入，过滤后的染液直接经过滤器下端均匀滴染在组织处，约30s后放入双蒸水中清洗1次。

⑥ 苏木精复染1min，1％盐酸乙醇分化，流水返蓝3min；

⑦ 甘油明胶封固。

注意事项

① 石蜡切片不能用于油红O染色，原因在于石蜡包埋过程中需要脱水，脱水过程中需要乙醇-二甲苯和石蜡，二甲苯是有机溶剂，会把中性脂肪溶解。

② 冰冻切片准备时，包埋的降温过程建议选择干冰，原因在于若选择液氮降温过程较强烈，可能导致组织内部炸裂，而干冰降温的过程比较缓和，染出来的片子比较好看。

③ 实验设计建议设计阴性对照和阳性对照，如阳性对照可以用脂质丰富的肝脏组织等，阴性对照可以根据文献来选择无脂肪沉积的组织等等。