产品名称：WB实验外包

一、基本原理

Western Blot 通过电泳将蛋白质分离，然后将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或 PVDF 膜）上。接着，利用特异性抗体与目的蛋白结合，再通过标记的二抗进行检测，以确定目的蛋白的存在、大小和相对丰度。

二、主要步骤

1. 提蛋白：取根据分组给药处理48h过的六孔板中的细胞，将6孔板中上清用移液器弃掉，每孔用1ml 1×PBS润洗2次，吸净孔中液体，用0.5毫升的胰酶消化，室温条件下一分钟作用。终止消化后将细胞吹下来，尽量不要产生气泡。
2. 转移到EP管中，做上标记并配平后，1000rpm，5min，保留细胞沉淀，每管加入150μl细胞裂解液（100μl ripa+1μl pmsf，需提前从-20℃冰箱拿出化冻），吹打混匀。置于冰上裂解半小时，放入-80℃冰箱，冻融3次，打开高速低温离心机，温度降低到4℃才可以使用，离心机14000转离心30min（高速离心机使用时一定要配平）。用10μl移液器小心吸取上清，不要沉淀。
3. BCA定量：

(1)    首先，需要准备标准蛋白溶液。我们移液器吸取15微升的标准蛋白溶液（浓度为10mg/ml）到EP管中，然后再添加285μl的生理盐水，从而得到浓度为0.5mg/ml的标准蛋白溶液。接着，按照表4中预先设计好的浓度梯度，配置8管不同浓度的标准蛋白溶液。

表 标准蛋白梯度浓度配制

(2)    接下来，对蛋白样品进行稀释。我们取72μl的生理盐水到EP管中，做好标记，再加入8微升的蛋白样品，将其混匀，相当于稀释10倍。这一步的目的是使样品的浓度范围与标准蛋白溶液的浓度范围相匹配，以便后续进行比较和分析。

(3)    按照分组，每组三个复孔，每孔20微升样品和200μl的AB液混合液。

(4)    随后，将96孔板板盖拿掉后放入酶标仪中，在37摄氏度条件下间隔振荡30分钟。这一步的目的是让AB液与蛋白质发生反应，形成有色化合物，其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比。

(5)    *后，测量每个孔的吸光度值，然后分析数据。

(6)    根据BCA定量的结果调整样品蛋白的浓度，使各组的浓度相同，用ripa作为稀释液稀释，再加入等同于蛋白溶液体积1/4的5×loading buffer，用涡旋混匀器混匀后，在电磁炉中水浴100℃ 15min，降到室温后放入-80℃冰箱中保存。

4. 制胶：用去离子水将玻璃板冲洗干净，晾干后装配到夹板上。用超纯水检漏，确定不漏后弃去板缝中的超纯水，用滤纸吸干。根据实验要求，按照配方配制10%的分离胶，配置过程中需注意AP*后加，并且要快速地混匀；混匀后用移液器沿着板缝边缘缓缓加入7ml分离胶，尽量不要产生气泡，加完后，沿板缝上方来回移动缓慢加入1ml异丙醇。静置25分钟左右分离胶就会凝固。将异丙醇倒掉，用滤纸吸附残余的异丙醇。将1.5mm、10孔规格的梳子用纯水洗干净，插入板缝中间。按照配方配置5%的浓缩胶，混匀后用移液器抵着梳子和玻璃板边缘之间的缝隙加入，移液器中液体不要打完，避免产生气泡。加满后室温静置至完全凝固（25min左右）。
5. 上样：将蛋白样品、Marker以及1×loading buffer取出置于冰上化冻，因为蛋白质容易降解，所以必须要放到冰上化冻。将制好的胶放入电泳槽中，量取30ml的10×电泳液用纯水稀释到300ml，得到1×电泳液，在板中间加电泳液，直到溢出到槽中。拔掉梳子，按照顺序将样品小心而又缓慢地加入到胶孔内，剩下的孔用1×loading buffer补齐，防止样品飘逸。
6. 电泳：将电泳盒的盖子盖好，注意电极的正负，设置恒压80v，开始后电泳盒中有小气泡产生，则说明有电流回路。大约四五十分钟后，观察Marker的位置，若Marker已完全分开，则将电压改为恒压120v，继续电泳直至loading跑至分离胶底部时关闭电泳仪。
7. 转膜：在塑料槽中倒入一定量的甲醇，将所需的PVDF膜用签字笔写上相关信息做好标记，将膜浸入甲醇中浸泡，将其激活，使其更易与蛋白质结合。将转膜夹和两个海绵垫用纯水洗净后放入盒中（转膜夹黑面在下），加入转移液直至浸没海绵，取3层滤纸浸润转移液后放于转膜夹黑面上，用玻璃管赶去气泡，将胶取出（胶体有毒，要戴手套操作），切除浓缩胶和多余的分离胶（丢弃到垃圾桶里，不能放到洗手池中，防止堵塞下水道），将分离胶倒置于滤纸上，放PVDF膜，放三层滤纸，每步操作之后都需要赶走夹层中的气体（残留的气体会影响到转膜的效果）。转膜夹夹好，放入槽中，将转移液倒满槽。将电泳盒放入盆中，加冰，保证电泳盒周围被冰块围绕，再加入一定量的水，盖上盖子，设置电流160mA恒流，转膜3h后，停止转膜，关闭电泳仪。
8. 封闭：将转膜得到的PVDF膜取出，可以观察到清晰的Marker条带，放入1×TBST中洗一下。放入封闭液中30分钟。
9. 用加了吐温的TBS洗PVDF膜8分钟×3次，再用TBS洗膜8min，清洗完毕后，取一泡沫板，放上干净的一次性塑料手套，再放上膜，用滤纸吸干水分，根据所需孵育一抗的分子量，用锋利的刀将膜裁开，标记上所孵育的蛋白，放入提前配置好的一抗中4℃孵育，孵育20h。
10. 孵育20h后将膜取出，TBST洗膜8min×3次，在*后一遍时根据一抗的种类配置二抗。将洗好的膜放入二抗溶液中，4摄氏度2h。TBST洗膜8分钟×3次，TBS洗8min。
11. 打开显影仪，配置显影液。用滤纸将显影板擦干净，夹取需要显影的膜到显影板上，不要产生气泡，滴加显影液，放入显影仪中显现结果，拍照记录，根据需要调整图片，得到清晰的条带，修改图片名称，做好记录。重复上述操作给其他的PVDF膜显影。结束后将图片保存到自己的优盘里。

三、应用领域

1. 蛋白质表达分析：检测特定蛋白质在不同组织、细胞或不同处理条件下的表达水平变化。

2. 蛋白质定位研究：确定蛋白质在细胞内的定位。

3. 蛋白质相互作用研究：通过共免疫沉淀结合 Western Blot 检测蛋白质之间的相互作用。

4. 疾病诊断和研究：在医学领域，用于检测疾病相关蛋白质的表达变化，为疾病的诊断和研究提供依据。

四、实验服务

分子实验平台：高效运作了qRT-PCR、Western blot、双向电泳技术、分子克隆与质粒构建、流式细胞仪检测、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀、RNA免疫沉淀、凝胶电泳迁移实验、酶联免疫吸附测定、外泌体抽提及鉴定等实验。

基因组学平台：可以完成甲基化检测、基因芯片分析、高通量测序等实验。

蛋白组学平台：能实现LC-MS、ITRAQ、蛋白质修饰分析等重点实验项目。

病理学平台：涉及免疫荧光染色、免疫组织化学染色、HE染色、特殊染色等实验。

生物信息学分析：文本挖掘，芯片表达谱分析，序列分析，转录因子靶点预测，高通量测序数据分析等项目

临床前CRO服务：主要提供呼吸系统、神经系统、免疫系统性疾病的药效学评价服务，包括靶点验证、体内外模型的构建、药物筛选、药物分析、药效性评价、药代动力学和药理学研究以及院内制剂研发等。

项目转化服务：助力客户进行方案设计、联合课题申报、药物项目引进和孵化，解决客户对实验技术平台、专业人才、zhuanli申请和融资的需求；

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