产品名称：WB实验

一、实验原理

蛋白免疫印迹（ Western Blot，WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。 WB 是进行蛋白质分析*流行和成熟的技术之一。

二、实验步骤

1. 制胶：用去离子水将玻璃板冲洗干净，晾干后装配到夹板上。用超纯水检漏，确定不漏后弃去板缝中的超纯水，用滤纸吸干。根据实验要求，按照配方配制10%的分离胶，配置过程中需注意AP*后加，并且要快速地混匀；混匀后用移液器沿着板缝边缘缓缓加入7ml分离胶，尽量不要产生气泡，加完后，沿板缝上方来回移动缓慢加入1ml异丙醇。静置25分钟左右分离胶就会凝固。将异丙醇倒掉，用滤纸吸附残余的异丙醇。将1.5mm、10孔规格的梳子用纯水洗干净，插入板缝中间。按照配方配置5%的浓缩胶，混匀后用移液器抵着梳子和玻璃板边缘之间的缝隙加入，移液器中液体不要打完，避免产生气泡。加满后室温静置至完全凝固（25min左右）。

1. 上样：将蛋白样品、Marker以及1×loading buffer取出置于冰上化冻，因为蛋白质容易降解，所以必须要放到冰上化冻。将制好的胶放入电泳槽中，量取30ml的10×电泳液用纯水稀释到300ml，得到1×电泳液，在板中间加电泳液，直到溢出到槽中。拔掉梳子，按照顺序将样品小心而又缓慢地加入到胶孔内，剩下的孔用1×loading buffer补齐，防止样品飘逸。
2. 电泳：将电泳盒的盖子盖好，注意电极的正负，设置恒压80v，开始后电泳盒中有小气泡产生，则说明有电流回路。大约四五十分钟后，观察Marker的位置，若Marker已完全分开，则将电压改为恒压120v，继续电泳直至loading跑至分离胶底部时关闭电泳仪。
3. 转膜：在塑料槽中倒入一定量的甲醇，将所需的PVDF膜用签字笔写上相关信息做好标记，将膜浸入甲醇中浸泡，将其激活，使其更易与蛋白质结合。将转膜夹和两个海绵垫用纯水洗净后放入盒中（转膜夹黑面在下），加入转移液直至浸没海绵，取3层滤纸浸润转移液后放于转膜夹黑面上，用玻璃管赶去气泡，将胶取出（胶体有毒，要戴手套操作），切除浓缩胶和多余的分离胶（丢弃到垃圾桶里，不能放到洗手池中，防止堵塞下水道），将分离胶倒置于滤纸上，放PVDF膜，放三层滤纸，每步操作之后都需要赶走夹层中的气体（残留的气体会影响到转膜的效果）。转膜夹夹好，放入槽中，将转移液倒满槽。将电泳盒放入盆中，加冰，保证电泳盒周围被冰块围绕，再加入一定量的水，盖上盖子，设置电流160mA恒流，转膜3h后，停止转膜，关闭电泳仪。
4. 封闭：将转膜得到的PVDF膜取出，可以观察到清晰的Marker条带，放入1×TBST中洗一下。放入封闭液中30分钟。
5. 用加了吐温的TBS洗PVDF膜8分钟×3次，再用TBS洗膜8min，清洗完毕后，取一泡沫板，放上干净的一次性塑料手套，再放上膜，用滤纸吸干水分，根据所需孵育一抗的分子量，用锋利的刀将膜裁开，标记上所孵育的蛋白，放入提前配置好的一抗如GAPDH、IRE1α、GRP78中4℃孵育，孵育20h。
6. 孵育20h后将膜取出，TBST洗膜8min×3次，在*后一遍时根据一抗的种类配置二抗。将洗好的膜放入二抗溶液中，4摄氏度2h。TBST洗膜8分钟×3次，TBS洗8min。
7. 打开显影仪，配置显影液。用滤纸将显影板擦干净，夹取需要显影的膜到显影板上，不要产生气泡，滴加显影液，放入显影仪中显现结果，拍照记录，根据需要调整图片，得到清晰的条带，修改图片名称，做好记录。重复上述操作给其他的PVDF膜显影。结束后将图片保存到自己的优盘里。