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一、总蛋白提取
1. 材料准备
(1) 组织样本或细胞样本。
(2) 蛋白提取裂解液，通常含有去污剂、蛋白酶抑制剂等。
(3) 匀浆器、离心机等设备。
2. 操作步骤
2.1对于组织样本：
将新鲜的组织切成小块，放入预冷的匀浆器中。加入适量的蛋白提取裂解液，在冰上进行匀浆，使组织充分裂解。
2.2对于细胞样本：
(1) 取根据分组给药处理48h过的六孔板中的细胞，将6孔板中上清用移液器弃掉，每孔用1ml 1×PBS润洗2次，吸净孔中液体，用0.5毫升的胰酶消化。
(2) 终止消化后将细胞吹下来，尽量不要产生气泡。将细胞转移到EP管中，做上标记并配平后，离心机1000rpm离心5min，弃上清。
(3) 每管加入150μl细胞裂解液（100μl ripa+1μl pmsf，需提前从-20℃冰箱拿出化冻），吹打混匀。
(4) 置于冰上裂解半小时，放入-80℃冰箱，冻融3次，打开高速低温离心机，温度降低到4℃才可以使用，离心机14000转离心30min（高速离心机使用时一定要配平）。
(5) 用10μl移液器小心吸取上清，即为提取的总蛋白溶液。
二、BCA定量：
(1) 首先，需要准备标准蛋白溶液。我们移液器吸取15微升的标准蛋白溶液（浓度为10mg/ml）到EP管中，然后再添加285μl的生理盐水，从而得到浓度为0.5mg/ml的标准蛋白溶液。接着，按照表4中预先设计好的浓度梯度，配置8管不同浓度的标准蛋白溶液。
表 标准蛋白梯度浓度配制
|
蛋白浓度（mg/ml） |
0 |
0.025 |
0.05 |
0.1 |
0.2 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
|
生理盐水（μl） |
80 |
76 |
72 |
64 |
48 |
32 |
16 |
0 |
|
0.5mg/ml的标准蛋白（μl） |
0 |
4 |
8 |
16 |
32 |
48 |
64 |
80 |
(2) 接下来，对蛋白样品进行稀释。我们取72μl的生理盐水到EP管中，做好标记，再加入8微升的蛋白样品，将其混匀，相当于稀释10倍。这一步的目的是使样品的浓度范围与标准蛋白溶液的浓度范围相匹配，以便后续进行比较和分析。
(3) 按照分组，每组三个复孔，每孔20微升样品和200μl的AB液混合液。
(4) 随后，将96孔板板盖拿掉后放入酶标仪中，在37摄氏度条件下间隔振荡30分钟。这一步的目的是让AB液与蛋白质发生反应，形成有色化合物，其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比。
(5) *后，测量每个孔的吸光度值，根据标准蛋白溶液的浓度和吸光度值绘制标准曲线，根据待测蛋白提取液的吸光度值，在标准曲线上计算出对应的蛋白浓度。
(6) 根据BCA定量的结果调整样品蛋白的浓度，使各组的浓度相同，用ripa作为稀释液稀释，再加入等同于蛋白溶液体积1/4的5×loading buffer，用涡旋混匀器混匀后，在电磁炉中水浴100℃ 15min，降到室温后放入-80℃冰箱中保存。
