产品名称：人体肌肉组织卫星细胞流式检测

1、材料准备

1. 新鲜的人体肌肉组织样本；
2. 无菌手术器械，如手术刀、镊子等；
3. 细胞解离液，可选择适合肌肉组织的酶类解离液；
4. 无菌 PBS（磷酸盐缓冲液）；
5. 针对卫星细胞的特异性抗体；
6. 流式细胞仪及配套软件；
7. 细胞过滤器；
8. 离心管；
9. 染色缓冲液；
10. 培养基。

2、操作步骤

2.1 样本处理

(1)  手术室获取的新鲜肌肉组织浸泡于含有无菌HBSS的50 mL离心管中，快速运输至实验室，运输过程中注意防止污染；

(2)  到达实验室后，在提前准备好的超净台内将肌肉放置于100 mm×20 mm 培养皿中，用无菌剪刀和镊子去除脂肪、血管、肌腱等结缔组织，留下肌肉并称质量，记录标本的质量；

(3)  将处理好的标本移入50 mL离心管，加入含有体积分数10% 胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液，肌肉标本在4 ℃冰箱中可保存5-7 d；

2.2 组织解离

(1)  行多参数流式细胞分选当天，将肌肉从4 ℃冰箱中取出，在提前准备好的超净台内将肌肉放置于100 mm×20 mm培养皿中，将保存肌肉的含有体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液也移入其中，用无菌剪刀和镊子将肌组织剪碎至约1 mm3 大小，能顺利通过10 mL移液管即可；

(2)  将剪碎的标本用10 mL移液管移至50 mL离心管中，1500 r/min离心 5 min，去上清；

(3)  用10 mL移液管将每2.0-3.0 g的肌肉标本移至30 mL消化液中(消化液由HBSS和Ⅰ型胶原酶、Ⅳ 型胶原酶、分散酶组成，酶的终质量浓度分别为100，100，1.2 mg/L)，然后放至台式恒温振荡器中，37 ℃ 60 r/min 消化1.0-2.0 h，每隔20 min取出标本置于超净台中，用移液管吹打10次，并观察消化情况。当观察到块状组织消融，消化如浆液状即可，具体消化时间可根据消化程度进行调整；

2.3 细胞过滤

(1)  消化完全后，加入大约10 mL含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液终止消化， 1500 r/min 离心5 min，小心去上清；

(2)  将组织重悬于大约10 mL含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的 DMEM培养液中，用移液管吸取离心好的组织通过70 µm 滤过膜滤过，滤过过程中用含体积分数10%胎牛血清、1% 青霉素/链霉素的DMEM培养液冲洗，并不停的旋转移液管，使滤过充分；

2.4 离心收集细胞

(1)  将过滤好的组织标本1500 r/min离心 5 min，小心去上清。将细胞重悬于1 mL红细胞裂解液中，反复吹打混匀，室温放置10 min；

(2)  然后1500 r/min离心 5 min，去上清，*后重悬于1 mL DPBS中，过40 µm滤膜滤过后计数(也可上机前进行)。

2.5 抗体标记

(1)  将单细胞悬液离心，弃去上清液。

(2)  用适量的染色缓冲液重悬细胞。

(3)  加入特异性一抗，在合适的温度（通常为 4℃或室温）下孵育一定时间，一般为 30 分钟至数小时。

(4)  如果一抗不是荧光标记的，需加入荧光标记的二抗，再次孵育。

2.6 流式细胞仪检测

(1)  用染色缓冲液洗涤细胞，去除未结合的抗体。

(2)  将标记好抗体的细胞悬液调整到合适的浓度，上流式细胞仪进行检测。

(3)  根据抗体所带的荧光标记设置流式细胞仪的参数，如不同的荧光通道等。

2.7 数据分析

(1)  流式细胞仪软件会生成细胞的散点图和直方图等。

(2)  根据卫星细胞的特定标记物的荧光信号，在图中圈出阳性细胞群体，即可能的卫星细胞。

(3)  分析卫星细胞的比例、荧光强度等参数。

3、注意事项

1. 抗体的选择要准确，确保其特异性针对卫星细胞的标志物。
2. 严格控制孵育时间和温度，以保证抗体结合的效果。
3. 流式细胞仪的操作要规范，避免出现误差和污染。
4. 数据分析时要结合对照样本，排除非特异性信号的干扰。
5. 整个操作过程应在无菌条件下进行，以防止污染。
6. 选择合适的细胞解离液和解离时间，避免过度解离导致细胞损伤。
7. 操作要轻柔，尽量减少对细胞的机械损伤。
8. 及时进行细胞计数和活力检测，以便评估制备效果。

4、参考文献

[1]古晶晶,杨继辉,杨婷婷,等.多参数流式细胞术分选人骨骼肌源性血管内皮细胞和血管外膜细胞的方法[J].中国组织工程研究,2018,22(21):3357-3364.