智启医学新维度
服务电话： 180-1784-7121（微信同号）
小鼠腹腔巨噬细胞分离纯化
一、实验原理
小鼠腹腔巨噬细胞分离及纯化的基本原理是巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可存活 2～3 周，难以长期生存，多做原代培养。可用多种方法培养不同来源的巨噬细胞，其中以小鼠腹腔取材法*为常用，从小鼠腹腔渗出细胞中分离及纯化巨噬细胞，正常小鼠每只可收集腹腔渗出细胞约106，其中巨噬细胞占30％。如果给小鼠腹腔注射某种刺激物，可使巨噬细胞渗出增加，易于分离更多的巨噬细胞。
二、实验材料和用品
6-8周龄健康小白鼠，普通光学显微镜，10ml低速离心机，解剖盘，解剖剪，10ml离心管，5ml一次性注射器，生物**柜（超净台），0.9% NaCl生理盐水，DMEM培养基，
三、实验流程
1. 脱颈处死小鼠，75%乙醇浸泡5min，消毒**。
2. 后续实验在生物**柜中操作，使小鼠仰卧于解剖盘上。
3. 向腹腔注射生理盐水：用注射器吸取5mL生理盐水或细胞培养基，提起小鼠腹中部的皮肤和腹膜，让针头从提取处穿刺进入小鼠腹腔，缓缓推注生理盐水或细胞培养基，轻揉小鼠腹部数次，静置3-5min，使液体在腹腔内充分流动。
4. 解剖暴露腹膜：用镊子提起下腹皮肤，使其与腹膜分开，在镊子提取处将皮肤剪开一个小口，再向上、向下剪开整个腹部皮肤，双手食指拇指分别在腹中部捏住两侧皮肤慢慢向两边撕开，使腹膜暴露。
5. 抽取腹腔液：用手夹住小鼠一侧皮肤，中指向内挤压内脏，在腹腔内形成空腔，将注射器针头插入缝隙处抽取腹腔液，再将腹腔液注入离心管。
6. 细胞培养：将收集的腹腔灌洗液在1000r/min条件下离心10min，弃去上清，PBS润洗一遍，加入细胞培养基重悬并进行细胞计数，调整细胞浓度后接种至细胞培养瓶，37℃培养箱培养4-6h，待巨噬细胞充分贴壁后，弃去上清，更换新的细胞培养基后，放回培养箱中继续培养。
四、注意事项
1. 从下腹部一侧进针注入灌洗液，以确保针眼收缩，不至于因腹腔液的增加而从针眼处出血，避免血细胞混入巨噬细胞悬液中。
2. 腹腔注射后应轻揉腹部，既要避免渗血，又要确保巨噬细胞游离出来，然后彻底灌洗，尽可能获得较多的巨噬细胞。如果吸出的灌洗液液呈淡黄色，则获得的巨噬细胞较多；如果吸出的灌洗液仍为无色透明，获得巨噬细胞则较少。分析此现象可能是游离出的大量巨噬细胞使其环境变为酸性所致。
3. 无菌条件下打开腹腔，直视吸取，可防止因吸入肠系膜或腹膜等而堵塞针眼的现象，并可迅速且较完全地吸出灌洗液。
4. 收集炎性腹腔巨噬细胞时，处死小鼠前先用注射器向小鼠腹腔注射 1 ml 3% 豚蛋白胨肉汤或 2 ml 无菌的液体石蜡，待 3~4 天后按上述步骤收集。
5. 暴露腹膜时注意不要将肚皮剪破。
6. 抽取腹腔液针头不能扎到肠子或内脏。
7. 实验操作时要注意无菌操作。
