主营产品:
动物实验动物实验外包科研实验外包上海动物实验水迷宫实验外包动物实验外包公司动物造模动物模型构建动物行为学实验细胞实验细胞实验外包细胞培养实验细胞周期实验细胞增殖检测细胞凋亡检测
产品与服务

上海达为科生物科技有限公司

电话:021-55130726

传真:021-55130728

联系人:张艳

电话:18017844061

邮箱:jierdun@jrdbio.com

地址:上海市长江南路180号长江软件园B区B638室  



详细内容

动物实验中嗅觉的评估方法

嗅觉是人体原始的感觉功能之一,它同视觉、听觉一样,是人体捕获外界信息的特殊装置。嗅觉还可以通过**神经系统影响人的情绪、调节生命周期。嗅觉障碍患者对周围的事物不感兴趣,反应平淡,生活质量下降,更可以造成精神上的压抑或忧郁。王鸿等报道用T&T测试法测试了1035例慢性鼻窦炎鼻息肉患者,86.3%的患者有嗅觉功能障碍,与患者的主诉有极显著的差异,说明嗅觉功能改变没有受到患者的注意。近几年随着人们对生活质量要求的提高,对嗅觉障碍的关注程度有了很大的提高。

嗅觉评估不仅仅是要判断嗅觉功能是否正常,还需要进一步判断嗅觉障碍的程度、性质、部位等因素,如果能提示病因以及预后则更有临床、实验应用的价值。在动物实验中关于嗅觉功能的研究已经有了较长的历史,出现了多种实验方法,但是目前为止还没有一个、客观、高特异性的金标准方法出现,本文就目前动物实验中的常见的嗅觉评估方法进行一个概括性的介绍。

1 行为学方法

动物实验和临床试验的大区别在于动物无法准确地和实验者交流,所以行为学方法在动物实验中就显得极为重要。嗅敏动物的学习记忆能力、寻食能力等与嗅觉有很高的相关性,可以观察、记录其行为学的改变,从而判断其嗅觉功能的变化。目前报道较多的可以评估嗅觉功能的行为学方法有以下几种。

1.1 埋藏食物小球实验(buried food pellet test,BFPT)

BFPT是目前常用于检测动物嗅觉功能的行为学检测方法。目前比较通用的方法由Nathan等于2004年报道,他的实验中使用找寻食物小球等待时间作为数据进行统计分析,即从小鼠被随机放置于盒子中开始,到小鼠揭开食物小球并用它的前爪或牙齿抓住食物小球的时间,如果5 min(300 s)内小鼠未找到食物小球,即被移走。林静等以300 s(5次测试的平均值)内未找到食物小球作为判定小鼠存在嗅觉功能障碍的标准,并认为以300 s作为分组标准是合理的。

1.2 嗅觉测量仪

Slotnick等利用行为学原理设计出一种用于动物实验的嗅觉测量仪,可以通过改变气味的浓度后观察动物的行为学变化来评价其嗅觉。该系统经众多实验验证其对动物嗅觉的检测是有效的,因操作方便且可进行多种设计,此方法被广泛应用于动物嗅觉功能的评估。

1.3 双瓶实验

有研究证实小鼠、大鼠在分辨某些物质的时候主要是依赖于嗅觉而非味觉,例如盐酸、盐酸奎宁(quinine HCl, QHCl)等有挥发性的物质。因嗅觉障碍时动物分辨饮用水和实验溶液的能力下降,通过两种溶液被动物饮用的程度可以评估动物嗅觉障碍的程度。

1.4 幼鼠超声发声实验

新生小鼠嗅觉的产生比其他的感觉要早。新生小鼠嗅到成年鼠窝的气味时可发出一种超声作为回应,检测这种超声的出现与否可以判断其嗅觉功能是否正常。Lemasson等用3-甲基吲哚来破坏新生小鼠的嗅上皮,结果成功地证实了该检测方法的可行性。而且在该实验中发现由于被破坏嗅觉的小鼠无法正确识别**,其生存率大大降低,证明了嗅觉对新生小鼠有极其重要的作用。

行为学方法在动物实验的嗅觉评估中有很重要的作用,历史悠久、技术成熟,实验方法较为简单,实验装置花费较少,对嗅觉功能的初步评估价值较为(尤其是埋藏食物小球实验和Slotnick的嗅觉测量仪),可行性及可重复性较高。需要注意的是本类实验受个体差异影响较大,实验前应经预评估剔除先天差异比较大的个体,而且样本量不宜过小,有时候还需对动物进行预先的训练。为实验的客观性,需要很好地进行实验设计与控制,有时连昼夜节律等变化的影响都需要考虑在内。行为学测试结果对嗅觉功能评估只是一个综合的结果,对嗅觉障碍程度、部位等的判断较差,如果能结合嗅觉诱发电位等客观检查可以做到更加客观、可信。在过去的实验中行为学测试往往与组织学检查相结合,既增加了实验的客观性,又为进一步研究嗅觉产生机制或嗅觉障碍的原因提供了基础。

2 客观评估方法

嗅觉的感受、传导是个比较复杂的过程,气味分子通过鼻腔到达嗅黏膜后被其表面的黏液所吸附,进而在黏膜层中扩散,到达嗅细胞。达到阈浓度的气味分子可刺激嗅细胞产生嗅觉电位,这是其感受过程。产生的嗅觉电位通过嗅神经穿过筛骨筛板,到达嗅球,其内有第2级神经元,再通过嗅束传导至初级嗅皮质及皮质内侧核,而后至海马回的内嗅皮层即次级嗅皮层,神经冲动引起大脑皮层的激活才能后引发嗅觉。嗅觉功能的客观评估方法包括了对嗅觉感受、传导通路上各种指标,例如影像学、电生理学、组织学等的测量。目前动物实验中使用较多的及可能有较大发展前景的客观评估方法包括以下几类。

2.1 组织学方法

这里的组织学是泛指解剖取组织后进行的所有检查,包括大体解剖学、病理学、**学、分子生物学等诸多学科的检查方法。嗅觉系统的改变既可以由病变本身引起也可以是因为嗅觉障碍后的退行性变引起。组织检查比结构影像检查更有评估价值,因其可以更好地提示病因,也利于更好地研究嗅觉通路和嗅觉障碍产生的机制。目前组织学方法在动物实验中有很广泛的应用,从部位选择上看整个嗅觉传导通路包括从嗅黏膜直到海马回的内嗅皮层都有报道,从实验方法上看更是复杂多样,常用的几种方法有如下几种。

2.1.1 病理学检查

这是早期**学技术及分子生物学技术还不是很发达时常用的检查手段,在早期嗅觉研究中有较多的应用,在嗅觉障碍的动物标本上可以看到细胞凋亡、空泡等变化,虽然特异性较差,但是也能提供宏观的信息,现在常常和其他检查方法一起使用,例如在陈志宏等的实验中在进行其他检查之前使用了HE染色方法检查了模型小鼠的嗅上皮,发现其嗅上皮变薄,其中的感觉神经元的细胞核层数变少。

2.1.2 蛋白及核酸表达的检查

对相应组织中某些标志性蛋白及核酸的检查可以间接地反映嗅觉功能及提示嗅觉障碍的原因。例如用**组化方法检查嗅觉通路中嗅标记蛋白(olfactory marker protein, OMP)、酪氨酸羟(tyrosine hybroxylas, TH)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)c-Fos蛋白等标记物在许多文献中都有记载。Buron[10]在丙酮吸入诱导的嗅觉障碍实验中使用了嗅上皮组织的OMP及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)作为观察指标,发现丙酮对于嗅上皮的损伤是有选择性的。有学者使用多巴胺及细小白蛋白作为标记物进行**组化检查,发现失嗅动物模型的嗅球中含多巴胺及细小白蛋白的神经元细胞数量明显减少,认为通过该失嗅动物模型可以对嗅球萎缩进行定量描述,提示多巴胺及细小白蛋白在嗅球中的表达对于失嗅的作用。c-Fos蛋白可反映大脑组织活动程度,c-Fos蛋白的观察可以程度上起到功能磁共振的作用。

2.2 电生理学方法

2.2.1 嗅电图

将电极直接置于嗅区黏膜,当其接受嗅素刺激时记录到的一种慢相负性电位变化称为嗅电图,目前普遍认为它是单个嗅细胞电位变化的总和,嗅电图已经在动物实验中得到证实。嗅电图大的缺陷在于虽然其对嗅黏膜损伤引起的嗅觉障碍有较大的意义,但是对于黏膜后传导通路以及嗅球、海马回等**病变导致的嗅觉障碍没有什么评估价值。

2.2.2 嗅觉脑电图

嗅觉诱发脑电图是指在给予嗅刺激时,实验对象的脑电图可发生变化,Hirano等用狗做实验时成功地获得了该变化,在他的实验中发现脑电图的快波对嗅觉功能的意义较大。嗅觉诱发脑电图又相继在大鼠等其他动物身上得到了验证。嗅觉脑电图产生的机制还不是很明确,而且其特异性不是很高,故目前在动物实验中研究、应用的较少。

2.2.3 嗅觉诱发电位

又称为嗅觉事件相关电位(olfactory event-related potentials,OERP),早是用电刺激动物嗅黏膜时在头皮特定部位记录到稳定的脑电位的变化,该方法经过一段时间的发展后认为其和自然嗅觉之间有的差距,故逐渐被化学气味诱导的嗅觉诱发电位所取代,目前使用的已经比较少。早期化学气味刺激除了有嗅觉刺激外还常常伴有物理刺激及对三叉神经的化学刺激,这些非嗅刺激干扰了正常嗅觉诱发电位的获得。随着仅能兴奋嗅觉系统而不兴奋三叉神经系统的化学物质如香草醛等,以及Kobal式嗅觉刺激器的出现,嗅觉诱发电位研究成为嗅觉研究领域的热点。嗅觉诱发电位仪至少包括嗅觉刺激器及脑电采集系统,测量时需要在电声屏蔽室进行,且需要给予的白噪声掩蔽刺激探头释放刺激时产生的干扰噪声。目前动物嗅觉诱发电位各波的具体来源以及与**间的相互关系还不清楚,嗅觉诱发电位的出现是否意味着动物确实产生了嗅觉还不能,所以用来证明嗅觉传导通路是否畅通比较可行,而暂不能用于嗅性**的定位、定性诊断。嗅觉诱发电位应该是可能成为动物嗅觉评估客观标准的检查方法。

3 影像学方法

3.1 嗅觉系统结构影像检查

有研究证明嗅球及嗅束等神经结构的生长与周围神经冲动的输入有关,所以嗅觉障碍后嗅觉系统各部位可有的不依赖于年龄的结构改变,通过磁共振影像检查可以发现这些改变,例如嗅球体积变小、嗅沟缺失或变浅、嗅束缺失等现象,从而间接评价嗅觉功能。

3.2 嗅觉系统功能影像检查

这是目前嗅觉研究的热点方向之一,主要技术有功能性磁共振成像(fMRI)PET成像和脑信号的光学成像等。

3.2.1 功能磁共振检查

功能磁共振检查技术有很多,用于嗅觉系统功能的fMRI技术主要是(blood level dependent fMRI, BOLD fMRI),当氧合血红蛋白的比例增加时或去氧血红蛋白含量减少时,T2信号缩短效应减弱,表现为MR信号增强。嗅觉功能成像既能反映血流的变化,也能反映神经元活动的代谢变化,近些年在研究神经功能方面发挥着巨大的作用,特别是fMRI无放射暴露,可反复测试,且时间、空间分辨率要优于PET成像,故是目前嗅觉功能成像的主要方法。在大鼠实验中已经证实,7 TfMRI能够显示气味刺激后大鼠嗅球的活化。其空间分辨率很高,对于研究嗅觉相关皮层的定位、嗅觉功能障碍情况下嗅觉相关皮层反应的变化等有的应用价值。有学者拟通过信息技术将啮齿类动物嗅球的激活图像编成二维的气味图(OdorMap,OM)及气味图数据库(OdorMap Database,OMDB)以利于嗅觉工作者对嗅觉系统的研究。功能磁共振应用在动物实验的嗅觉评估中需要注意的是:动物是不能配合磁共振检查的,故需要在麻醉下进行;其次磁共振是强磁场环境,故嗅觉刺激装置不能由金属制成。

3.2.2 脑功能光学成像

脑功能光学成像是近年来神经外科的热点研究方向,目前主要的实验技术有激光散斑衬比成像和内源信号光学成像。而应用于嗅觉功能检查的主要是内源信号光学成像,这里所指的内源信号,并不是神经元所表现出来的电信号,而是指由神经元活动所引起的有关物质组分、运动状态的改变而导致其光学特性的变化,在与某些特定波长的光量子相互作用后,得到的包含了这些特性的光信号,包括:血红蛋白信号、氧合血红蛋白信号、光散射特征信号等。许多生理性过程如血红蛋白氧合度、细胞色素的氧合状态、神经胶质和神经元肿胀、功能性血流量改变等变化,都会影响到组织光反射特性的改变。通过探测反射光的变化量,就可以获得这种特异性的内源光学信号。内源光学信号成像在动物实验中已用于多种脑功能皮层功能的检查,比如视觉(猫、小鼠等)、躯体感觉皮层(大鼠、猫、松鼠猴等)、听觉皮层(南美栗鼠、猫、雪貂等)Bathellier等在实验中使用了内源光学信号原理和突触素荧光标记两种方法分别获得了香芹酮、苯甲酸甲酯刺激后大鼠嗅球的激活情况,在内源光学信号成像下,激活的嗅小球反光率下降,呈相对的冷色调,而在荧光标记实验中激活区域荧光反应较强。虽然内源光学信号成像的时空分辨率都较高,但是其穿透脑皮层的能力受限(大约数百微米),所以对于深层脑组织的观察就没有什么效果了。由于内源光学信号的生理来源至今没有定论,所以为了阐述内源光信号对应的生理意义及其与神经元电活动的关系,还需要与其他方法进行对比研究。

从其他感觉的评估方法来看,功能磁共振和诱发电位是研究的发展方向,但目前嗅觉产生、传导机制尚未明了,相关检查技术尚处于起步阶段,还需要进行大量的研究。目前的嗅觉研究可以根据不同的实验要求及实验条件选择不同的实验方法及实验方法的组合。嗅觉诱发电位及功能磁共振检查由于其初期投入较大,对硬件及技术条件要求较高,开展难度较大,在国内只有少数医院在从事这方面的实验。行为学方法操作简单,技术成熟,效果,有很强的实用价值。组织学方法对于机理的研究十分重要,并且随着对嗅觉认知的加深,越来越多的标记物被发现,评估方法也越来越丰富。如果可以出现一种简单易行的嗅觉评估方法,那么可以地促进嗅觉的研究。

Copyright@ 2003-2020  上海达为科生物科技有限公司版权所有      电话:0756-2183150 传真: 地址: 邮编:
         沪ICP备15041491号     

沪公网安备 31011302004470号