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细胞实验中徒手切割法体细胞克隆研究进展


1997年2月,英国<Nature》杂志报道了英国罗斯林研究所的Wilmut等利用绵羊乳腺细胞进行核移植试验,成功地获得了上只体细胞克隆绵羊——多利(Dolly)。这一成果有力地证明了成年哺乳动物的体细胞仍具有发育上的全能性,从而开创了哺乳动物细胞核移植的新里程碑,在生物科学史上具有十分重要的意义。到目前为止,体细胞克隆技术已相继在多种动物上获得成功,并显示出巨大的应用潜力和社会效益。

目前影响动物体细胞核移植广泛应用的主要技术因素有:

(1)核移植效率低;

(2)实验所需设备费用高。技术难度大;

(3)妊娠率和产仔率低,出生后死亡及异常发育率高。

在克隆过程中成熟卵母细胞去核是核移植技术中的一个重要环节。要求去得干净,又尽可能地减少对细胞质的损伤。如果去核不,可导致重组胚染色体的非整倍性,造成多倍体,卵裂异常,发育受阻和胚胎早期死亡。而如果要去核势必要损失细胞质,否则要使用荧光染色技术。目前使用的主要是显微操作去核,需要价格昂贵的显微操作仪和熟练的技术操作人员。此外,还需要相关的辅助工具制作设备如研磨机、微锻炉等,而对其使用也需的技术水平。这些要求相当程度地限制了核移植技术的简化及广泛应用。研究不需要显微操作设备的核移植技术将会对体细胞核移植技术在细胞实验的实际应用起到巨大推动作用。

1、细胞实验HMC技术

徒手切割法体细胞克隆(Handmade Somatic Cell CloningHMC)是一项不需要显微操作的核移植方法,早是Peura等 进行牛胚胎细胞克隆时建立的,Vajta等【3 进一步发展了此方法,成功应用于牛的体细胞核移植,并且得到后代 。HMC技术路线主要包括卵母细胞的去透明带,徒手切割半卵法去核,双半卵融合、激活,以及支持无透明带卵/胚胎培养技术。

1.1 卵母细胞去透明带

1.2 卵母细胞的去核

1.3 卵母细胞的融合

目前常用的是电融合,根据电融合的次数可以分为一步法和两步法。融合的电压与动物的种类有关。BLS细胞融合仪是一款专门为哺乳动物设计的细胞融合仪,产品小,易操作,性价比极高.HMC技术结合BLS细胞融合仪CF-150B的使用,已成为此领域研究人员的理想选择.

1.31 一步法

在电融合槽中一次同时将2枚去核后的半卵和1枚供核体细胞粘合在一起进行融合,从而提高电击融合效率。

具体做法是:将半卵细胞与供体细胞先放入含有植物凝集素(PHA)TCMHEPES液滴中,通过圆头粘合细玻璃针拨动使一枚半卵先与一枚供体细胞粘合,然后再与另一枚半卵粘在一起,其排列顺序为:体细胞一半卵~半卵,然后进行电融合。在融合槽中施加交流电场,可使已经粘成一串的3个细胞自动排序,再给与直流电脉冲,可以一次性同时融合处理143细胞串,从而大大提高融合效率。电击后3Orain内观察融合情况,没有融合的再进行电击一次。

在牛的电融合实验中,其融合率达到(9568±397) ]。利用一步融合法已经生下5头体细胞克隆牛犊。也可以采用先将一枚半卵与一枚供体细胞用PHA法粘合,然后放入融合槽时再加入一枚半卵。 通过手工拨动使粘有体细胞的半卵与另一枚半卵排序,然后通过提供电压的交流电场使3个细胞紧密联结在一起,再应用直流电脉冲一次性使3个细胞融合,一次可以融合处理4对细胞。

1.32 两步法

相对一步法而言,主要是进行两次电融合。

具体过程:

半卯与供体细胞经过有植物凝集素(PHA)TCMHEPES液滴的处理后,一枚半卵先与供体细胞融合,融合后的半卵再与另一枚半卵进行融合,但是第二次融合的电压要比次的低。根据Vajta等的报道,经过两次融合,融合率可以达到76。运用此法进行核移植也得到克隆牛犊-4j

1.4 卵母细胞的激活

激活处理主要是化学激活,与常规相同。但也有化学激活与电激活相结合的。采用化学激活时去透明带的卵母细胞在二甲氨基嘌呤(DMAP)中采用微穴培养系统(WOW)培养法,一般每孔3O100个,具体依据实验的细胞数目而定。Kragh等 用HMC技术进行猪的体细胞核移植时使用化学激活和电激活相结合的方法,激活率为(49±1)

1.5 重构胚的培养

与传统核移植重构胚的培养方法不同,HMC的胚胎由于去除了透明带,其培养系统要能够防止重构胚的相互粘连,因而采用隔离法群体培养。

1.51 微穴培养系统(well of the wellWOW)

WOW 先报道于Vajta等 ,其简要过程如下:在四孔培养皿中加入培养液并覆盖石蜡油预热,然后用胚胎聚集针通过手腕用力并旋转,在培养皿的底部均匀分布地压下3070(视每组实验培养的卵母细胞数而定)圆锥形小凹。小凹的底部直径约为120n,上口直径约300 fm,深度约为350 n

1.52 明胶一孔系统

用胚胎培养液无牛血清白蛋白(BSA)和氨基酸]溶解明胶,浓度为196。在四孔板的孔中铺上一层明胶,然后加入胚胎培养液并在上面覆盖石蜡油。用直径为5O100rn的塑料小管在明胶上作孔,每孔放一个胚胎进行培养。

1.53 微管法培养(GO 系统)

GO系统(the glassoviductsystem)就是将重构胚放人一端封Vi的毛细玻璃管中,玻璃管径的大小要适宜,将培养液加入到玻璃管中然后进行培养。Thouas等在研究小鼠的合子体外发育时,发现GO系统培养的囊胚其内细胞团、滋养外胚层以及早期桑椹胚的细胞数目明显高于微滴法培养囊胚的细胞数,但操作不如微滴法简便。

1.6 核移植胚胎的冷冻

2、细胞实验HMC技术的应用前景

与常规核移植方法相比,HMC技术大的特点是对实验设备的要求相对而言不是太高,不需要显微操作仪,而且对技术人员的要求也降低许多。常规去核方法主要依靠极体定位,因此需要是有极体排出的成熟卵母细胞;而HMC技术则不需要那么严格,只要成熟的卵母细胞细胞质均匀即可,从而可以提高卵母细胞的利用率。但HMC技术需要两个卵母细胞才能得到一个重组胚,因而从整体上限制了核移植的成功率,但是核移植的效率却可以大大提高。此外由于在融合时两个半卵胞质体来自不同的卵母细胞再加上供体细胞,重构胚的DNA有可能来源于三方面,对胚胎的进一步发育可能会产生影响。

目前通过此方法得到克隆动物还不多,只有牛的成功报道,但是在其他动物如猪 、绵羊现在也展开了研究,并且取得了进展。Vanessa等用HMC技术进行牛的体细胞连续核移植(SHMC),成功得到一头小牛。同时HMC技术有独特的优势如进行胚胎嵌合的研究]。总之,HMC技术由于其独到的优势,将会促进核移植技术的发展。随着该方法进一步的提高和完善,HMC技术在哺乳动物的体细胞克隆胚胎产业化生产中将发挥重要作用。

BLS细胞融合仪与HMC技术相结合,以成为该领域研究人员的较好选择.


 


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