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详细内容

用端粒酶诱导人类间充质干细胞永生化实验

端粒酶对染色体的稳定性及决定细胞生命周期起极其重要的作用。端粒酶或末端转移酶是由两个主要的亚单位构成:RNA成分(hTR)和蛋白质分解亚单位(hTERT,RNAhTR)亚单位普遍表达于正常和肿瘤组织中,而蛋白质分解亚单位(hTERT)仅在肿瘤细胞、生殖谱系细胞及激活的**细胞中表达。

实验步骤     

材料

无菌

生长培养基:含高浓度葡萄糖(4.5 g/L)的 Dulbecco's modifiled Eagle's 培养液(DMEM),添加L-谷酰胺 2 mmol/L10% 胎牛血清、100U/mL 青霉素及 100 μg/mL 链霉素

聚凝胺: 8 mg/mL

普通容器 :培养瓶 25 cm275 cm2

反转录酶病毒载体的产生用材料

细胞系:

PG13

GP+E-86

反转录病毒载体 GCsam hTERT

转染用 htrt DNA

Tx 缓冲液 :总量 20 mL,含有以下物质:

HEPES 0.5mol/L,pH 7.1   200μL

NaCl,5rnol/L   100μL

Na2 HPO4/NaH2PO4,1mol/L   3μL

UPW   1.7 mL

缓冲液 A:总量 20.04 mL,含有以下物质:

NaCl(5mol/L   600μL

EDTA(0.5mol/L40μL

Tris-HCl,pH7.50.5mol/L400μL

UPW   19 mL

hMSC(人间充质干细胞)细胞的转导用材料

hMSC(人间充质干细胞)细胞

培养瓶 75 cm2

多孔板 6 

转导后用材料

用于冷冻保存的实验材料(见方案 20.1

用于 DNA 指纹分析 (见方案 16.8)  DNA 图谱分析(见方案 16.9)或其他验证分析方法的实验材料(如方案 16.10

PCR 试剂

DNA 100 μg/mL

10×PCR 缓冲液 L(含 Mg2+

正向引物(2μmol/L

反义引物(2μmol/L

dNTP 混合物(10 mmol/L

DNA 聚合酶

UPW

操作步骤

反转录酶病毒载体的产生

具有 hTERT 基因的反转录酶病毒载体通过两个步骤包装进入长臂猿白血病病毒(GALV)包装的细胞系PG13。,使用 20 μg/mL htrtDNAGeron)转染包装细胞系 GP+E-86,然后用上清液感染 PG13细胞。

1. 6.7×105 GP+E-86 细胞系接种在一个小培养瓶(25 cm2)中。

2.GP+E-86 细胞系的转染

a)将 280μL Tx 缓冲液加人每个管中(常用容器)。

b)制备 DNA 

c)将 Tx 缓冲液逐滴加人含有 DNA 溶液的管内,轻轻地混合。

d)在室温下孵育 30℃,使其产生沉淀。

e)在每个含有 GP-E-86 细胞的 25 cm2 培养瓶中,加入 5 mL 新鲜培养液。

f)轻轻加入混合液(Tx+DNA)至 GP+E-86 细胞,在 37℃ 孵育 4-6 h

g)在 25 cm2 培养瓶内,用 D-PBSA 小心地洗三次。

h)加新鲜培养液至细胞中,在 37℃ 孵育隔夜。

3. 更换细胞培养液,加 2 mL 新鲜培养液 (取代以前 5 mL 培养液),以产生病毒。

4. 在进行第三步的同**,将 1×104  PG13 细胞接种于 6 孔板的每个孔中。

5. 次日,从感染的 GP-E-86 细胞收获其上清液,加入终浓度为 8 μg/mL 的多聚胺 ( 1 μg/mL 上清液)

6. 用孔径 0.45μ滤膜过滤上清液,将 2 mL 过滤液加至含 GP-E-86 细胞的每个孔中。

7. 在 32 1000 g 离心培养板。

8. 在 37℃ 孵育隔夜。

9. 次日,更换细胞的培养液。

hMSC 细胞的转导

1. 将 2×106 PG13 细胞种人 75 cm2 培养瓶中。

2. 次日,将 6 mL 新鲜培养液加至 PG13 细胞中。

3. 第三日,将 hMSC 细胞(约 2.5×104~7.5×104 个)加至 6 孔板中,用于转导。

4. 从包装的细胞收获上清液,加入终浓度为 8 μg/mL 的多聚胺,用孔径 0.45μ的滤膜过滤上清液。

5. 将2mL过滤后的反转录病毒上清液加入 6 孔板的每个孔中。

6. 在32℃ 1000 g 离心培养板,37℃ 孵育隔夜。

7. 吸去逆转录病毒上清液,加入新鲜培养基。

转导后培养物的处理

1. 经过10~12次传代接种,未接受hTERT基因的细胞将死亡,剩余的细胞 则已插入hTERT基因,具有hTERT基因的细胞将在传代过程中被选择出来。

2. 建议将细胞分装在安瓿中冷冻保存,建立一个转导细胞的贮备库,这些转导细胞处于不同的群体倍增(PI)水平(可与 PD 生长曲线相匹配)。这样做也可节省时间,因为如果发生污染就要丢弃培养的细胞,重新开始。

3. 在梅次传代培养时,用下列公式获得PD,以建立PD生长曲线。

公式中的PD代表种群倍增的次数,In 是自然对数 Nstart 是细胞初始接种量,Nfinish 是细胞在传代培养过程中所获得的全部细胞数。

 1,如果初种入2×105个细胞,培养后增加至3.2×106个细胞,则:

如果按 1:4 的细胞量进行传代培养,则每次传代培养后的 Nfinish 将乘以 4。所以在上述例子中,假设有 10 次传代培养,Nfinish 就是(3.2×106)× 10 倍,也就是 3.4×1012

 2,如果初种入2×105个细胞,培养后可增加至3.2×106个细胞。以1:4的细胞址传代培养10次,则:

4. 在建立永生细胞系之后,检查其真实性,以其来源于初的材料, 而不是由于交叉污染从实验室其他永生细胞系衍生而来。这是能做到的,例如针对转移基因(hTERT)的PCR 检测、DNA 指纹检 测 DNA 图谱检测

hTERT的PCR

1. 溶解PCR试剂并保存在冰块中

2. 对下列试剂进行仔细的混合,记住,要包括阳性对照(其他hTERT阳性标本)和阴性对照(无DNA模板)

DNA1μL100ng100μg/mL

10×PCR缓冲液(含 Mg2+2μL

正义引物   2μL

反义引物   2μL

dNTP 混合物(10 mmol/L   0.4μL

DNA 多聚酶   0.1μL

UPW   12.5μL

终体积为 20 mL(包括 DNA

3.将管子置于PCR仪器中,按以下步骤进行操作:90℃,3 min,进行变性作用;94℃,30s,再次进行变性作用;59℃,39s,进行复性;74℃,1 min,进行延伸;如此循环30个周期,然后是74℃,1 min

4. 将PCR产物在1.5%~2%琼脂糖凝胶中进行电泳。

 

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