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实验性自身免疫性重症肌无力动物模型的建立

重症肌无力(myasthenia gravisMG)是一种神经肌肉接头传递障碍的获得性自身**性**。病变主要是累及神经-接头突出后膜上乙酰胆碱受体(acetylcholine receptorAchR)。临床主要表现为受累骨骼肌肉极易疲劳,经休息和服用抗胆碱酯酶药后可部分恢复为特征。乙酰胆碱受体抗体(AChR antibody AChRab)的增加是MG发病机制中的主要因素,但是其致病机理和**方法尚有待于进一步完善,因此研究实验性动物模型的制备具有重要意义。

当人们意识到AChRAbMG发病关键所在之后,1973Pat rick等从电鳗电器官提取纯化AChR ,**接种新西兰大白兔后获得实验性自身**性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis EAMG)模型,后来在大鼠、小鼠、豚鼠、猴用同样方法也制备了EAMG模型。随着蛋白质组织化学的发展,现已掌握了人及一些实验动物AChR主要致病区的肽链结构,因此出现了用合成多肽作为**原制备EAMG模型的方法。

1 模型制备方法

1.1AchR蛋白为**原建立动物模型从丁()双鳍电鳐的电器官分离乙酰胆碱受体(AchR)**大鼠,建立实验性重症肌无力(EAMG)动物模型。方法:参照徐浩鹏等方法从丁()双鳍电鳐的电器官提取AchR蛋白,并采用Folin酚试剂法及酶联**吸附法(ELISA)检测提取蛋白的含量及活性;以提取的蛋白主动**Lewis大鼠,健康、雌性8周龄Lewis大鼠24只随机分为3组,即正常对照组、福()佐剂(CFA)对照组、AchR+CFA实验组,每组8只。实验组大鼠分别于足垫、腹部及背部皮下多点注射乳剂1.5mL,第4周再次注射上述乳剂**大鼠。CFA对照组只接受等量CFA皮下注射。

1.2MG患者血清中的AchR抗体建立动物模型重症肌无力被动转移小鼠模型(P-EAMG)的制作,血清阴性(SNMG)和血清阳性(SPMG)组小鼠每日分别腹腔注射SNMGSPMG患者血清0.6mL,连续7天。对照组小鼠注射方法同P-EAMG组。所有小鼠定义词注射血清后24h腹腔注射环磷酰胺(300mg/kg),以抑制小鼠对人血清蛋白的**反应。还有用胸腺移植建立重症肌无力动物模型,Schonbeck等将MG患者的胸腺组织移植到严重**缺陷小鼠肾被膜下12周后,在小鼠血清中可检测到抗人AchRAb11周时抗人AchRAb滴度增至重度MG水平,且在骨骼肌运动终板处可见Ig沉积。说明MG患者的胸腺组织能诱导和维持自身抗体产生。MG患者切除胸腺后细胞**、体液**均受抑制,AchRAb减少,纠正了MG**调节紊乱,故70%的患者症状缓解或改善。

1.3采用乙酰胆碱受体单克隆抗体体建立动物模型采用乙酰胆碱受体(nAchR)单克隆抗体mAb35建立C57BL /6幼年小鼠重症肌无力被动转移模型。健康清洁级,雌性C57BL /6小鼠48只, 45周龄,体重1214 g参照文献将实验动物分为实验组(E)和对照组(N),实验组分为3(E1E2E3) 每组12只。分别经腹腔注射含0.51.01.5mg/kg mAb35Ringers0.2mLB6幼年小鼠,对照组(N)注射不含mAb35Ringers0.2mL

1.4基因疫苗**小鼠建立重症肌无力动物模型郝志波等,用基因疫苗pcDNA2AchR-α211**C57BL/6小鼠建立实验性自身**性重症肌无力模型(EAMG)。方法:将人乙酰胆碱受体α亚基N端的主要**区(AChRα211)的基因片段插入到穿梭载体pcDNA3.0中,构建基因疫苗pcDNA2AChR-α211。大量提纯质粒pcDNA2AChR-α211后肌肉注射C57BL/6小鼠。用ELISA法检测小鼠血清中抗AChR-α211IgG(AChRAb),并用PCR方法检测外源基因在小鼠各组织器官中的分布情况。

此外,用鼠源乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段(R97-116)复制EAMG模型;吴怀国等乙酰胆碱受体α亚基125-147肽段制作实验性重症肌无力动物模型的研究。

2观察指标

2.1临床观察按Lennon[15]的分级法将症状严重程度分为4级。0级:没有的无力表现;1级:撕咬无力,四肢力量较差,在光滑地面上前肢打滑,活动减少且易疲劳;2级:明显无力,休息时身体呈隆起姿势,头尾下垂,大腿外展,前肢趾弯曲,动作笨拙,行走不稳;3级:严重无力表现,无撕咬动作,肌肉震颤,呼吸困难,濒死或死亡。

2.2AChR数目的计算将正常小鼠和EAMG小鼠后肢肌肉溶于1%(体积分数)TritonX-100中,分别加入过量125I标记过的α-银环蛇毒(α2But x)的磷酸盐缓冲液,孵育13h后加入过量兔抗鼠IgG进行**沉淀反应,所得沉淀物用磷酸盐缓冲液冲洗2遍后用γ-计数仪计数,并用标准曲线求取已结合抗体的AchR数。EAMG模型的AChR数目应较正常鼠明显减少。

2.3肌电图动物麻醉后固定于解剖板上,将成对刺激电极以23mm距离插至坐骨切迹附近肌肉内,记录电极置于腓肠肌内侧头(跟腱附着处)。重复用50100Hz电刺激时EAMG模型的腓肠肌电位及收缩波幅呈衰减反应。

2.4光镜观察实验动物断颈处死,迅速取其腓肠肌,以40g/L多聚甲醛固定,常规制作石蜡切片。然后用011moL/Lα2Butx标记辣根过氧化酶(α2Butx2HRP)孵育切片1h,用PBS3次,后用联苯二胺双氧水(DAB2H2O2)于室温下显色,在光学显微镜下观察运动终板上AChR数目的改变。光镜下可见EAMG动物神经末梢和肌纤维处有巨噬细胞浸润,部分肌细胞呈节段性坏死,运动终板上AchR数目减少。

2.5电镜观察实验小鼠断颈处死,迅速取其腓肠肌,用高碘酸盐2赖氨酸2多聚甲醛(PL P)液固定2h,沿肌纤维走行切成0.15cm×0.15cm×1.1cm大小块,用PBS冲洗,放至0.1moL/Lα2 Butx2HRP中,于4℃孵育2h ,用PBS洗净,以DAB2H2O2显色。用立体显微镜观察,选择NMJ多的部位行25g/L戊二醛及锇酸固定,脱水,环氧类树脂(Epon812)包埋,制成6μm切片,经醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后,用EM100/CR电镜观察。电镜下显示EAMG动物突触后区域简单化,突触后膜皱褶退化,突触间隙加宽。通过TJ TY-400 TC图像分析仪测量神经末梢面积、突触前后膜长度及其比值、突触后膜面积。EAMG动物显示平均突触后膜面积减小,突触后膜长度变短,突触后膜与前膜长度比值变小。

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