三油精诱导的急性脂肪栓塞大鼠动物模型的建立

脂肪栓塞(Fat Embolism, FE) 是各种原因导致脂肪进入血液循环,在血管内出现大量脂肪滴引起广泛栓塞,从而引起一系列病理生理改变与临床表现。FE在创伤病人中十分常见,尤其常见于长骨或骨盆骨折。Allardyce研究了43例股骨活动性骨折的病人发现95%的病人血循环中有脂肪球。Fabian前瞻性地研究了为期12个月的股骨、胫骨、骨盆骨折的病人,在这些人中,脂肪栓塞综合征(FES)的发病率至少为11%。Fabian报道该病病死率为10%,而Bulger报告为7%。在该病的科研中,FE动物模型具有至关重要的作用。我们建立的三油精诱导的大鼠FE动物模型,具有可控性强、重复性好、简便易行的优点,从而为该病的研究提供了坚实的物质基础和实验平台,现报道如下:

1 材料

1.1 实验动物:清洁健康Wistar大鼠26只,雌雄兼顾,体重280～320g,由南京医科大学动物实验中心提供,正常饲养。

1.2 脂肪栓子:采用合肥博美生物科技有限公司提供的生化级三油精(又称油精和甘油三油酸酯,英文Triolein)作为脂肪栓子。

1.3 实验器材:美国Power Lab多功能生理监测仪、美国i-STAT血气分析仪及3+试纸片、小动物解剖器械、一次性注射器等。

2 实验动物分组

实验鼠随机分为大剂量三油精组(n=10)、小剂量三油精组(n=10)和对照组(n=6)三组。

3 实验步骤

3.1 麻醉:经腹腔推注20 %乌拉坦,剂量为1g/kg,每半小时检查一次麻醉深度,必要时可追加麻醉,剂量为100～200 mg/ kg。

3.2 模型制备:本试验采用经大鼠颈外静脉注入三油精的方法制备急性FE动物模型。腹腔注射20%乌拉坦麻醉大鼠,麻醉满意后,仰卧位固定于自制大鼠手术台上,将颈部毛发剪除, 碘伏、酒精局部消毒,依次切开皮肤、皮下组织寻找颈外静脉穿刺置管,将三油精试剂用水浴复温至37℃后以0.2ml/min速度缓慢注射,使其发生脂肪栓塞。术中密切观察大鼠一般生命体征,整个栓塞过程大鼠应始终保持仰卧位并保持良好的麻醉化。大剂量组注入0.6ml/kg的三油精,小剂量组注入0.2ml/kg的三油精。对照组除用同容积生理盐水代替三油精外,余实验过程与试验组相同。

3.3 血流动力学监测:右颈动脉置管连接压力换能器后,采用美国Power Lab多功能生理监测仪于栓塞前5min测定大鼠平均动脉压(MAP)及心率(HR)并记录,栓塞后5min、30min、1 h、2 h复测上述指标。

3.4 动脉血气分析:所有大鼠麻醉后即**管切开并插入小动物气管切开管接Y管通气,在间断吸痰、吸入氧浓度(FiO2)为21%的情况下,于栓塞前、栓塞后30分钟,分别采右颈动脉血以美国i-STAT血气分析仪行血气分析,测定PH、PaO2、PaCO2、HCO3-。

3.5 病理检查:栓塞后6h每组放血处死2只大鼠,取出肺组织,观察大体标本有无肺梗死灶,全肺以体积分数为10%的甲醛液固定,石蜡包埋切片,苏木素一伊红(HE)染色,光镜下镜检观察肺组织病理学改变。

3.6 实验结果数据处理及统计学分析:实验数据均以均数±标准差(x±s)表示,数据结果采用SPSS13.0统计学软件包进行统计分析;统计方法采用方差分析,F检验,两两间比较采用q检验,检验以P<0.05表示结果统计学差异有显著性。

4 结果

4.1 模型建立情况:小剂量三油精栓塞组建模成功率为90% (9/10),死亡率为10%(1/10) ,大剂量三油精栓塞组建模成功率为70% (7/10),死亡率为30%(3/10)。栓塞后大鼠呼吸频率立即增快,平均频率>110次/min,伴有呼吸窘迫,气管切开管中分泌物增多,严重者有大量泡沫痰涌出。动脉血气分析显示程度不等的低氧血症。

4.2 病理观察:大体标本正常肺组织表面呈淡红色,无充血、水肿及瘀血斑点(见图1);FE后肺组织充血、水肿,表面有弥漫性出血点(见图2箭头所指)。光镜下正常肺组织结构完整,肺泡内无出血及渗出(见图3);FE后大鼠肺泡水肿、肺泡壁破坏(见图4箭头所指)。

4.3 平均动脉压变化结果(表1):小剂量三油精FE组5min、0.5h、1h点MAP与对照组、注栓前比较差异有显著性,P<0.05;大剂量三油精FE组5min、0.5h、1h、2h点MAP与对照组、小剂量组比较差异均有显著性,P<0.05。

4.4 心率变化结果(表2):小剂量三油精FE组5min、0.5h、1h点HR与对照组、注栓前比较差异有显著性,P<0.05;大剂量三油精FE组5min、0.5h、1h、2h点HR与对照组、注栓前、小剂量组比较差异均有显著性,P<0.05。

4.5 血气分析变化结果(表3):小剂量FE组栓塞后60min PaO2明显降低,与对照组、注栓前比较差异有显著性,P<0.05;大剂量FE组栓塞后60min pHa、PaO2、HCO3-均明显降低,与对照组、注栓前比较差异有显著性,P<0.05;大剂量FE组栓塞后60min PaO2与小剂量组比较差异有显著性,P<0.05。

5 讨论

FE是指脂肪颗粒阻塞血管腔而引起的一系列病理生理改变的临床疾病。临床所见的FE可以见于整形外科吸脂术、骨科长骨骨折、骨关节矫形手术、脂肪肝挤压伤等。

关于FE的动物模型:实验动物的种类包括大鼠、猫、家兔、绵羊、犬、猪及灵长类动物, 其中灵长类动物由于与人类在遗传进化水平上接近, 故是理想的实验动物, 但这种动物价格昂贵, 未能广泛用于实验中。与其它几种实验动物相比, 大鼠繁殖快, 较易得到, 价格上又较低廉, 适用于大样本的动物实验, 值得在动物试验中推广。脂肪栓子的种类包括:自体脂肪细胞、油酸、三油精。以自体脂肪细胞作为栓子制作FE动物模型,虽然可以较为真实地模拟FE发生的过程,但是提取与纯化自体脂肪细胞需要较复杂的技术和设备,实施起来有较高难度。以油酸作为栓子制作FE动物模型,由于游离脂肪酸对肺****内皮细胞的毒性作用,易导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)发生,所以油酸常用以制作ARDS的动物模型。三油精是一种不饱和的甘油酯,存在于动物和植物脂肪和油中,由动植物油类分离而制得,黄色油状液体,密度0.915,熔点-4～-5℃,不溶于水,微溶于乙醇,溶于氯仿、乙醚、四氯化碳。三油精可以作为天然脂肪栓子用于FE的动物模型的制备,国外已有多位学者进行了相关研究,但在国内尚无此类报道。以三油精作为脂肪栓子制作FE动物模型有如下优点:(1)成分单一,剂量容易把握,可重复性强,实验结果可靠;(2)取材简单,有专门厂家提供,且价格低廉。

当肺动脉主干或广泛肺动脉脂肪栓塞时,其急性期病理生理变化主要表现为血流动力学改变和呼吸生理改变。肺动脉栓塞的机械阻塞造成肺有效血管床横断床面积减少,由此引发的神经体液因素造成肺动脉持续痉挛,导致肺动脉高压形成。当肺动脉压持续升高超过右心负荷时,就造成急性右心衰竭。此时内脏血管强烈收缩,外周循环阻力增加,左心室回心血量严重不足,体循环血压降低,严重时表现为休克症状。