制作脑梗塞动物模型的几种方法

1.脑梗塞动物模型制作方法有以下几种。

1.1 光化学法 

腹腔内麻醉后，消毒并纵向切开头皮，暴露右侧颅骨，小心分离骨膜以免损伤颅骨表面影响其透光性。颅骨表面覆以中间带圆孔的避光纸，其下为感觉运动皮质中枢。从股静脉缓慢注入2%玫瑰红B后，将大鼠固定于立体定位仪上，冷光源探头贴近暴露的颅骨。此法优点在于皮层梗塞区部位可以选择，并不局限在大脑中动脉区；皮层损害大小一致，且能通过控制照射时间、强度、范围和光敏染料用量，制成不同大小和深度的梗塞模型。大缺点在于，无法复制再灌注损伤模型，且由于是性闭塞照射的动脉，妨碍扩血管药物的**观察。

1.2 开颅法 

经典方法是分离并电凝横过嗅束外缘或内缘处的大脑中动脉（MCA）造成脑梗塞和丝线结扎大脑中动脉造成脑梗塞，这是公认的标准开颅法（MCAO大脑中动脉梗塞）模型。采用电凝法阻断大脑中动脉，阻断血流，闭塞了大脑中动脉所有的可见分支，梗塞的效果更好。开颅法造成脑梗塞的模型一般就是开颅直接阻断大脑中动脉，可以说相当于性梗塞性人类卒中，其缺点在于：需要开颅，造成的创伤大，不易控制出血、感染等因素，影响血流变等的指标测定；模型造成后梗塞，无法观察到再灌注损伤效应。

1.3 线栓法（插线法）

该法是分离暴露颈部血管，从颈外动脉（ECA）或颈总动脉（CCA）分叉处插入外科4-0尼龙线，进入颈内动脉（ICA），阻断大脑中动脉起始端及其所有侧支血液供应，导致大脑中动脉局灶性缺血，时间后轻提插线，有阻力时提示丝线头端已达颈外动脉或颈总动脉切口处，即制成再灌注损伤模型，无需再次切开颈部。缺点：动物体质量要求严格，一般定为280~350g。

1.4 栓塞法  

栓塞法即直接将外部栓子，如血凝块或其他栓子注入血管，阻塞大脑中动脉，使出现大脑中动脉梗塞。本法造模优点在于：血凝块栓子栓塞脑血管，与临床上脑梗塞病理过程为接近，且不用开颅，只是由于栓子的随机性，无法预测梗塞的部位和大小成为其主要的缺点。

综合上述，我们得知的脑梗塞模型有着各自的优点和缺点，现在我们来探讨一种改良的栓塞模型，一种与人群中常见脑梗塞存在差异较小的模型。

2 实验动物的选择

2.1 种类 

，用于脑梗塞实验的动物有：大鼠、兔、狗、猴等。从进化角度来看，灵长类与人近似，如猴、长臂猿、猩猩、狒狒等，但此类动物数量比较少，价格昂贵；兔和狗因其脑部解剖和血管供应与人体有较大差异，价格也较为昂贵，因而也较少用；大鼠虽然从整体上与人类并不十分相似，但某些方面却与人类非常近似，如其自发性高血压的变化与人类相似，并伴有高血压性心血管病变，如脑血栓、梗塞、出血等症状，是研究脑血管病的佳动物；而且前人对大鼠的实验研究较多、较早，积累了大量的资料和方法可以参考借鉴，品系多，成本少，易于进行微生物方面的控制，大鼠可达到清洁级，SPF（无特定病原体动物）级及无菌级的试验。所以多选择用大鼠作为实验对象。

2.2 体重 

动物体重要适当，有研究发现，体重越小，死亡率越高。180g以下的大鼠死亡率可达70%，而350g以上的大鼠死亡率则在10%以下，但是体重过大的大鼠由于血管变粗，模型成功率不高。故而应选择体重在250~300g的大鼠，模型成功率较理想（80%）。

2.3 年龄 

大鼠脑部供血接近于人体，老年大鼠与老年人有相似的脉管系统退行性改变，如内皮变薄，血管基底层增厚，动脉硬化的血管壁胶原蛋白增加；脑内兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸平衡失调，线粒体数目减少及呼吸功能损害，血脑屏障破坏及免疫反应低下，对缺血缺氧的反应力差，易发生脑梗塞。相同实验条件下，缺血老年鼠较青年鼠神经细胞损害重，梗塞面积大。同等缺血损伤，老年鼠的精神状态改变、血脑屏障破坏、梗塞面积、神经细胞损害及炎性细胞浸润等均较青年鼠重；而胶质细胞和微血管增生等修复反应较青年鼠轻。基此认为模型制作应以老年大鼠[其标志是在50%的存活率时。Sprague-Dawley（SD）大鼠为14个月，Wistar大鼠24~30个月，以后者为好。

3 动物模型处理

临床上脑血栓患者多伴有高血压等合并症，在实验中我们直接通过给大鼠皮下注射大剂量肾上腺素，使血管收缩，外周阻力增加，血压升高，同时促进糖原及脂肪分解，使血糖升高，血中游离脂肪酸、乳酸增加，机体代谢增强，组织耗氧量显著增加等效应来模拟暴怒时机体的状态，从而使得老鼠处于高血压状态，引发模型大鼠的血液流变学各客观指标的异常改变，造成血瘀模型。血压测量用无创大鼠尾部测血压。

4 栓子的制作

制作血栓性脑栓塞动物模型，栓子的成分十分重要。所用栓子大多为异体栓子，如明胶海绵、硅胶、人或其它动物的全血血凝块等，还有部分栓子虽是自体的，但大多是动物自体全血凝固后形成的“红色血栓”，实为凝血块，其主要成分为红细胞、血小板，纤维蛋白含量较少，松软易碎，在体内易自溶，栓塞血管可自然再通。因此所用栓子可采用如下方法：麻醉，大鼠股静脉穿刺抽血，全血离心，离心结束后出现分层现象，取两层的交界处乳白色薄层（即白细胞和血小板层），迅速加入凝血酶，凝固后置于生理盐水中反复漂洗，取出称重，放入试管，加入生理盐水，然后将试管放入冰水烧杯（以防止高温变性）用超声波细胞粉碎机将其打碎，加入生理盐水配成栓子混悬液。制作栓子过程中尽量无菌。本栓子是由含血小板的健康动物血浆凝固而成的“白色血栓”，柔软且有韧性，不易自溶，而且容易制成微小栓子。

5 脑栓塞的形成

参考大鼠脑栓塞动物模型的制造方法，手术将栓子注射到动物颈动脉中。

6 评价指标

国内的脑梗塞动物模型的评价指标有两个方面：一是病理形态学观察；二是神经功能分级评价和学习记忆行为功能测定。

6.1 病理形态学观察 

主要是脑梗塞灶的染色切片观察，直观地观察动物模型的脑梗塞情况。此外还有对脑组织含水量测定，脑梗塞的体积测定等。

6.2 神经功能分级评价 

主要是采用5级评分法或4级评价法。学习记忆功能测定是反映脑梗塞模型动物的认知记忆能力的测定，脑梗塞通常都会导致大脑认知功能的缺损，表现为学习、记忆力的减退，因此此类测定具有的价值。主要使用的方法有迷宫实验、跳板实验，常用的是水迷宫实验。

6.3 脑梗塞率及稳定性的评定 

大鼠在术后24h冰上断头取脑，-20℃冷冻约15min。待其稍变硬时，用刀片将脑切成厚2mm的冠状切片。浸于质量分数为2%的TTC磷酸盐缓冲液中（pH=7.4），恒温浴槽中37℃避光孵育约15min，翻面继续染15min。正常脑组织染为深红色，脑梗塞区不染色（苍白色）。通过重量法测量脑的梗塞率，即：先称取全脑的重量Tm，随后仔细分离脑组织中梗塞部分并称重Pm，梗塞率（%）=（Pm /Tm）×，并计算出相对标准偏差（RSD）。

若模型动物神经功能评价按照5级评分法[4]的评分标准：0分：无神经功能缺损症状；1分：轻微神经功能缺损，不能伸展左侧前爪；2分：中度局灶性神经功能缺损，向左侧转圈；3分：重度局灶性神经功能缺损，向左侧倾倒；4分：不能自发行走，意识水平下降。符合2、3、4分，学习记忆能力测定——水迷宫法。测定并且与正常动物明显存在差异，脑部病理学切片显示梗塞区明显，则可证明模型造模成功。

7 小 结

选择老年大鼠作为实验对象，对其进行长时间注射肾上腺素，使得它处于高血压状态，并使用由含血小板的自体血浆凝固而成的“白色血栓”，注入老鼠颈动脉，建立复合模型。基于栓子的随机性，无法预测梗塞的部位和大小是我们这一模型主要的缺点。但正是因为栓子的随机性符合临床上脑梗塞弥散的特点，接近于临床脑梗塞病人的实际发病情况，能够较准确的反应其病变机理，并且我们的复合造模能在后续的药物**中发挥的作用，故此模型可作为研究脑梗塞的较为理想的模型。