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详细内容

制作脑梗塞动物模型的几种方法

1.目前脑梗塞动物模型制作方法有以下几种。

1.1 光化学法 

腹腔内麻醉后,**并纵向切开头皮,暴露右侧颅骨,小心分离骨膜以免损伤颅骨表面影响其透光性。颅骨表面覆以中间带圆孔的避光纸,其下为感觉运动皮质**。从股静脉缓慢注入2%玫瑰红B后,将大鼠固定于立体定位仪上,冷光源探头贴近暴露的颅骨。此法优点在于皮层梗塞区部位可以选择,并不局限在大脑中动脉区;皮层损害大小一致,且能通过控制照射时间、强度、范围和光敏染料用量,制成不同大小和深度的梗塞模型。大缺点在于,无法复制再灌注损伤模型,且由于是性闭塞照射的动脉,妨碍扩血管**的**观察。

1.2 开颅法 

经典方法是分离并电凝横过嗅束外缘或内缘处的大脑中动脉(MCA)造成脑梗塞和丝线结扎大脑中动脉造成脑梗塞,这是目前公认的标准开颅法(MCAO大脑中动脉梗塞)模型。采用电凝法阻断大脑中动脉,阻断血流,闭塞了大脑中动脉所有的可见分支,梗塞的效果更好。开颅法造成脑梗塞的模型一般就是开颅直接阻断大脑中动脉,可以说相当于性梗塞性人类卒中,其缺点在于:需要开颅,造成的创伤大,不易控制出血、感染等因素,影响血流变等的指标测定;模型造成后梗塞,无法观察到再灌注损伤效应。

1.3 线栓法(插线法)

该法是分离暴露颈部血管,从颈外动脉(ECA)或颈总动脉(CCA)分叉处插入外科4-0尼龙线,进入颈内动脉(ICA),阻断大脑中动脉起始端及其所有侧支血液供应,导致大脑中动脉局灶性缺血,时间后轻提插线,有阻力时提示丝线头端已达颈外动脉或颈总动脉切口处,即制成再灌注损伤模型,无需再次切开颈部。缺点:动物体质量要求严格,一般定为280~350g

1.4 栓塞法  

栓塞法即直接将外部栓子,如血凝块或其他栓子注入血管,阻塞大脑中动脉,使出现大脑中动脉梗塞。本法造模优点在于:血凝块栓子栓塞脑血管,与临床上脑梗塞病理过程为接近,且不用开颅,只是由于栓子的随机性,无法预测梗塞的部位和大小成为其主要的缺点。

综合上述,我们得知目前的脑梗塞模型有着各自的优点和缺点,现在我们来探讨一种改良的栓塞模型,一种与人群中常见脑梗塞存在差异较小的模型。

2 实验动物的选择

2.1 种类 

目前,用于脑梗塞实验的动物有:大鼠、兔、狗、猴等。从进化角度来看,灵长类与人近似,如猴、长臂猿、猩猩、狒狒等,但此类动物数量比较少,价格昂贵;兔和狗因其脑部解剖和血管供应与人体有较大差异,价格也较为昂贵,因而也较少用;大鼠虽然从整体上与人类并不十分相似,但某些方面却与人类非常近似,如其自发性高血压的变化与人类相似,并伴有高血压性心血管病变,如脑血栓、梗塞、出血等症状,是研究脑血管病的佳动物;而且前人对大鼠的实验研究较多、较早,积累了大量的资料和方法可以参考借鉴,品系多,成本少,易于进行微生物方面的控制,大鼠可达到清洁级,SPF(无特定病原体动物)级及无菌级的试验。所以多选择用大鼠作为实验对象。

2.2 体重 

动物体重要适当,有研究发现,体重越小,死亡率越高。180g以下的大鼠死亡率可达70%,而350g以上的大鼠死亡率则在10%以下,但是体重过大的大鼠由于血管变粗,模型成功率不高。故而应选择体重在250~300g的大鼠,模型成功率较理想(80%)。

2.3 年龄 

大鼠脑部供血接近于人体,老年大鼠与老年人有相似的脉管系统退行性改变,如内皮变薄,血管基底层增厚,动脉硬化的血管壁胶原蛋白增加;脑内兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸平衡失调,线粒体数目减少及呼吸功能损害,血脑屏障破坏及**反应低下,对缺血缺氧的反应力差,易发生脑梗塞。相同实验条件下,缺血老年鼠较青年鼠神经细胞损害重,梗塞面积大。同等缺血损伤,老年鼠的精神状态改变、血脑屏障破坏、梗塞面积、神经细胞损害及炎性细胞浸润等均较青年鼠重;而胶质细胞和微血管增生等修复反应较青年鼠轻。基此认为模型制作应以老年大鼠[其标志是在50%的存活率时。Sprague-DawleySD)大鼠为14个月,Wistar大鼠24~30个月,以后者为好。

3 动物模型处理

临床上脑血栓患者多伴有高血压等合并症,在实验中我们直接通过给大鼠皮下注射大剂量肾上腺素,使血管收缩,外周阻力增加,血压升高,同时促进糖原及脂肪分解,使血糖升高,血中游离脂肪酸、乳酸增加,机体代谢增强,组织耗氧量显著增加等效应来模拟暴怒时机体的状态,从而使得老鼠处于高血压状态,引发模型大鼠的血液流变学各客观指标的异常改变,造成血瘀模型。血压测量用无创大鼠尾部测血压。

4 栓子的制作

制作血栓性脑栓塞动物模型,栓子的成分十分重要。目前所用栓子大多为异体栓子,如明胶海绵、硅胶、人或其它动物的全血血凝块等,还有部分栓子虽是自体的,但大多是动物自体全血凝固后形成的“红色血栓”,实为凝血块,其主要成分为红细胞、血小板,纤维蛋白含量较少,松软易碎,在体内易自溶,栓塞血管可自然再通。因此所用栓子可采用如下方法:麻醉,大鼠股静脉穿刺抽血,全血离心,离心结束后出现分层现象,取两层的交界处乳白色薄层(即白细胞和血小板层),迅速加入凝血酶,凝固后置于生理盐水中反复漂洗,取出称重,放入试管,加入生理盐水,然后将试管放入冰水烧杯(以防止高温变性)用超声波细胞粉碎机将其打碎,加入生理盐水配成栓子混悬液。制作栓子过程中尽量无菌。本栓子是由含血小板的健康动物血浆凝固而成的“白色血栓”,柔软且有韧性,不易自溶,而且容易制成微小栓子。

5 脑栓塞的形成

参考大鼠脑栓塞动物模型的制造方法,手术将栓子注射到动物颈动脉中。

6 评价指标

目前国内的脑梗塞动物模型的评价指标有两个方面:一是病理形态学观察;二是神经功能分级评价和学习记忆行为功能测定。

6.1 病理形态学观察 

主要是脑梗塞灶的染色切片观察,直观地观察动物模型的脑梗塞情况。此外还有对脑组织含水量测定,脑梗塞的体积测定等。

6.2 神经功能分级评价 

主要是采用5级评分法或4级评价法。学习记忆功能测定是反映脑梗塞模型动物的认知记忆能力的测定,脑梗塞通常都会导致大脑认知功能的缺损,表现为学习、记忆力的减退,因此此类测定具有的价值。主要使用的方法有迷宫实验、跳板实验,常用的是水迷宫实验。

6.3 脑梗塞率及稳定性的评定 

大鼠在术后24h冰上断头取脑,-20℃冷冻约15min。待其稍变硬时,用刀片将脑切成厚2mm的冠状切片。浸于质量分数为2%TTC磷酸盐缓冲液中(pH=7.4),恒温浴槽中37℃避光孵育约15min,翻面继续染15min。正常脑组织染为深红色,脑梗塞区不染色(苍白色)。通过重量法测量脑的梗塞率,即:先称取全脑的重量Tm,随后仔细分离脑组织中梗塞部分并称重Pm,梗塞率(%=Pm /Tm)×,并计算出相对标准偏差(RSD)。

若模型动物神经功能评价按照5级评分法[4]的评分标准:0分:无神经功能缺损症状;1分:轻微神经功能缺损,不能伸展左侧前爪;2分:中度局灶性神经功能缺损,向左侧转圈;3分:重度局灶性神经功能缺损,向左侧倾倒;4分:不能自发行走,意识水平下降。符合234分,学习记忆能力测定——水迷宫法。测定并且与正常动物明显存在差异,脑部病理学切片显示梗塞区明显,则可证明模型造模成功。

7

选择老年大鼠作为实验对象,对其进行长时间注射肾上腺素,使得它处于高血压状态,并使用由含血小板的自体血浆凝固而成的“白色血栓”,注入老鼠颈动脉,建立复合模型。基于栓子的随机性,无法预测梗塞的部位和大小是我们这一模型主要的缺点。但正是因为栓子的随机性符合临床上脑梗塞弥散的特点,接近于临床脑梗塞病人的实际发病情况,能够较准确的反应其病变机理,并且我们的复合造模能在后续的****中发挥的作用,故此模型可作为研究脑梗塞的较为理想的模型。

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