利用CRISPR研究基因组“暗物质”

超过98%的人类基因组由非编码基因组成。这些非编码基因被称为基因组的“暗物质”，它们能调控编码基因的表达，从而影响人类健康和疾病进程。自从人类基因组序列被公开发表以来，科学家们努力解析基因中的功能元件，包括非编码调节区——参与转录调节的顺式调节区和非编码RNA（ncRNA）。转录因子在整个基因组中可能有数百至数千个结合位点，因此研究起来非常复杂。常用的两种研究转录因子调控基因表达位点的方法是：1，耗时且复杂的增强子研究；2，在非天然状态中克隆增强子或启动子序列，开展并行研究。近Sanjana等人和Fulco等人的研究都指出，可以利用CRISPR技术在天然状态里研究非编码调控元件的功能。

大规模的生化试验使人们发现了由潜在的、被数百种蛋白靶向结合的调节序列。值得一提的是，识别脱氧核糖核酸酶I超敏感位点（deoxyribonuclease I hypersensitive site， DHS）和大规模染色质免疫沉淀测序（chromatin immunoprecipitation–sequencing， ChIP seq）方法的提出，让科学家们能够地解析蛋白与染色质结合的情况。然而，把这些分子和功能调控联系起来非常困难。

由于使用不同的CRISPR载体可以无偏向性地敲除蛋白编码基因，因此CRISPR筛选是研究非编码基因功能的有力工具。与人类细胞中NGG（前间区序列邻近基序）序列上游的基因序列同源的单引导RNA（single guide RNA， sgRNA）可以引导CRISPR系统到达特定基因组位点，从而特异性地引起突变。CRISPR“敲除”筛选研究在基因组规模上诱导了全基因敲除，并克服了RNA干扰筛选中的诸多限制，例如脱靶效应和敲除不（图：CRISPR-Cas9筛选方法）。

Sanjana等人使用CRISPR工具来研究黑色素瘤细胞中调控vemurafenib（B-Raf蛋白V600E突变中，600位点的缬氨酸被谷氨酸所替代，而Vemurafenib抑制携带了V600E突变的B-Raf蛋白中的丝氨酸 – 苏氨酸蛋白激酶结构域）抗性的序列。研究人员使用CRISPR工具靶向主要的抗性调节区域——NF1（neurofibromatosis type 1，神经纤维瘤病1型基因）、NF2（neurofibromatosis type 2，神经纤维瘤病2型基因）和CUL3（cullin 3，泛素连接酶3）。该方法中，向导RNA和反式激活crRNA（trans-activating crRNA）融合，引导来源于酿脓链球菌的Cas9（spCas9）在目标位点处诱导DNA双链断裂，从而产生突变。结果显示，靶向CUL3的sgRNA在转录起始点为富集。sgRNA富集的区域，CUL3被敲除，这表明，CUL3似乎与染色体相互作用、组蛋白翻译后修饰，以及转录因子结合位点阻断的调控区域相关。

Fulco等人利用CRISPR干扰系统，即利用失活的Cas9和KRAB蛋白融合，沉默靶向序列的表达。这种方法虽然实现了靶向性的基因沉默，但并未引起基因突变。研究者们设计的靶向序列围绕在MYC和GATA1基因附近（这两个基因能调控K562红白血病细胞的增殖）。他们使用病毒感染细胞，将CRISPRi系统载带进入细胞，然后使用多西环素诱导dCas9靶向目标序列。他们发现，sgRNA富集点恰好和包含多个转录因子结合位点的DHS重合。更有趣的是，dCas9靶向GATA1或组蛋白脱乙酰酶6（HDAC6）增强子时，都会减少HDAC6表达。这表明，对于共同的增强子（GATA1和HDAC6存在共同的增强子），基因之间存在竞争关系。鉴定出来的MYC增强子的位置与转录起始位点、CCCTC-结合因子（CTCF，介导染色质相互作用）结合位点都是吻合的。这可能是MYC调控细胞增殖的机制。