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详细内容

原代细胞分离技术你了解吗?

1. 悬浮细胞的分离方法

1) 将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中,1000rpm/分钟离心5分钟。

2) 去掉上清,离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。

3) 用培养基重悬,调整适当细胞浓度后分瓶培养。

4) 如选用悬液中某种细胞,可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。

2. 实体组织材料的分离方法

1)机械分散法

a. 纤维成分较少的脑组织,部分胚胎组织,用剪刀剪碎至1mm3的组织块。

b. 用PBS清洗两次后

①用吸管吹打,分散组织细胞。

②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针),使细胞通过针头压出。

③或在不锈钢纱网内用钝物(注射器钝端)压挤使细胞从网孔中压挤出。

c. 收集细胞转入离心管中,1000rpm/分钟离心5分钟。

d. 去上清,加入含血清的培养基,重悬后移至培养瓶中培养。

2)消化分离法

酶消化分离法(过夜冷消化法)

a. 细胞间质较少的软组织,如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等,用Hanks液清洗组织三次,剪成碎块大小为4毫米左右。

b. 再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。

c. 加入0.25%的胰蛋白酶,摇匀后放4℃过夜。

d. 次日再用Hanks液洗涤,弃去上清,共洗2-3次。

e. 加入少量含血清的培养基吹打分散,细胞计数,按适当的浓度分瓶培养。

非酶消化法(EDTA消化法)

a. 把组织块剪碎,呈1mm3大小的组织块。

b. 将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。

c. 加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次),若组织块膨松呈絮状可终止,若变化不大可更换一次消化液,继续消化直至膨松絮状为止。

d. 弃去上清,加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应,并洗涤2-3次后,加入培养基。

e. 用吸管吹打,使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。

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