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详细内容

ChIP-Seq 遇见的那些事

1.怎么判断抗体满足ChIP要求?

通常每个公司的抗体说明都标有级别(grade),ChIP级。如果没有,通常的规则是ChIP-PCR分析阳性control是阴性control的5倍以上的抗体认为是到达了ChIP级。

2.如果没有商业化的kit怎么办?

表达的表位标记的蛋白也可以。经常使用的标签包括HA,Flag,Myc和V5。除了表位的抗体,所述靶蛋白也可以标记有生物素受体序列,其可以与生物素经由生物素连接酶在体内或体外进行标记。

3.多少细胞数合适?

10^6到10^7个细胞才能终得到10到100ng ChIPed DNA。一般10^6可以满足高丰度蛋白(如RNA polymerase II)和局部组蛋白修饰(如H3K4me3)的ChIP。如果是低丰度的转录因子蛋白和其他组蛋白修饰则需要10^7个细胞。

4.用什么作为Control?

关于control是问得多,也是困惑的一个问题。

不推荐IgG,原因是:,大多数的IgG抗体不是来源于转录因子或特定组蛋白抗体同一动物的**前血清。**,IgG通常pull down非常少的DNA,这样导致在后期的建库过程中PCR Cycles 数增加,导致不能达到作为control去除背景噪音的目的(会缺失和放大部分信息)。

因此比较而言,Input更适合作为control。Input的建库量够,这样建库过程不需要over-amplifed,bias小。其次,后测序得到的数据更均匀,以及全基因组覆盖度会更好。有人提到deletion 或者 RNAi knockdown目标转录因子的细胞同时做ChIP-Seq作为control更好。

5.是否需要生物重复?

有人建议需要生物重复,但是从目前我经历的项目来看,生物重复性不太好。还有人推荐用不同公司的抗体来做生物重复,这就需要考虑到经费的问题。

6.关于超声处理

超声没有什么特别的,需要注意的是超声处理在含有SDS的缓冲液中可能会破坏蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用。但是含有SDS的缓冲液能增加超声的效率,适应与DNA紧密结合的转录因子的ChIP-Seq。近遇到一个老师,他的项目是一个转录因子跟不同的Parters蛋白结合,再binding到相关的区域,行使调控功能。这种情况就不建议用含有SDS的缓冲液了。

7.交给Vendor后是否万事大吉?

这里还提些数据分析过程中需要注意的问题。需要多少数据量?大部分人认为20 Mb 是个比较适合选择。

Call peak不同软件各有优势。

Peak 类型

适合项目

工具

大(Broad)

组蛋白

CCAT,SICER

小(Sharp)

转录因子

MACS

大和小(Sharp&Broad)

ZINBA

需要注意的是重复区域的peaks可能被忽视,原因是在前期的数据处理过程中,mapped到不同位置的reads被丢掉,而这些reads大部分是因为比对到重复区域。

另外一个问题是怎么比较不同细胞和不同条件下ChIP后测序得到的数据。ChIP条件的不同,背景噪音也不同,加上测序系统误差,所以需要均一(normalization)的软件在样本比较前对数据进行预处理。近有个工具DIME可以处理这个问题。



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