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Tunel显色法细胞凋亡检测实验

Tunel显色法细胞凋亡检测实验

实验背景及原理:

     细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象,在生物体进化、内环境的稳定以及系统发育中发挥着重要的作用。细胞在发生凋亡时,会在生理生化和细胞形态上发生一系列变化,在凋亡中晚期,激活的DNA内切酶会切断核小体间的基因组DNA,DNA会被降解成为约180bp-200bp 的片段,而正常或者增殖细胞很少发生DNA断裂。利用这个差异,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT 酶)把Biotin标记的dUTP标记到断裂DNA片段的3’-OH 末端,用POD检测标记并用底物显色,然后进行显微镜观察,这个方法被称为TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法细胞凋亡检测。

应用:(1)可用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究;

      (2)可应用于临床诊疗,新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及从促凋亡角度探索肿瘤的基因**;

      (3)对相关**的早期发现、放化疗的疗效评价具有举足轻重的地位。

TUNEL检测法的优势:

    TUNEL法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

样本类型:石蜡包埋组织切片、组织冰冻切片、细胞涂片以及贴壁细胞

注意事项:为了避免试剂损失,使用前可以低速短暂离心融化后的试剂,然后小心开管取用;

          试剂盒使用后尽快放回-20℃冰箱保存;

          TUNEL反应液即用即配,不能配制好后存放;

          TdT 酶在-20℃保存时不会凝固,不需要提前取出融化,只需在使用前迅速从-20℃冰箱中拿出取用后立即放回-20℃保           存;

          POD反应液用POD贮液和POD稀释液即用即配,配制好后可以4℃保存(3个月),POD可以-20℃保存;

          标记反应混合液包含二甲胂酸钾(potassium cacodylate),避免接触皮肤和眼睛,操作时戴好手套;

          如果用于石蜡切片的检测,需用蛋白酶K,二甲苯处理;

          在标记反应中,推荐使用盖片或封口膜覆盖样本,反应液均匀分布,并避免孵育过程中缓冲液蒸发损失。准备覆盖           膜时,可剪下一片Parafilm®封口膜,使其稍大于样本,并将一角折起便于在接下来实验步骤中取放;

          用塑料或玻璃容器及纸巾自制湿盒,在样本处理过程中使用湿盒保持样本环境的湿润,避免样本干燥;

          固定样品,需自备多聚甲醛;

          悬浮细胞可用以下方法固定或贴附在玻片上:4°C缓慢离心(1000rpm)5分钟,去除细胞培养上清,并将细胞重新悬浮           在4%的甲醛溶液(溶于1×PBS 溶液)使其终密度为1×106/ml,室温孵育10 分钟。按照上述方法离心收集细胞,去除           固定液并用80%乙醇溶液以相同细胞密度重悬。固定后的细胞可以保存在4°C。固定后的细胞(100-300μl)可直接固           定在玻片上,使用聚L-赖氨酸包被的玻片可以提高细胞的黏附性。


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