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染色质免疫沉淀原来学问这么多?

染色质**沉淀原来学问这么多?
原理:在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为长度范围内的染色质小片段,然后通过**学方法沉淀此复合物,特异性的富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片段的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
一般步骤:甲醛处理细胞——收集细胞,超声破碎——加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合——洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联,纯化富集的DNA-片段——PCR分析。在PCR分析这一步,比较传统的做法是半定量-PCR,但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。
注意事项:
细胞生长状态要好,它会直接影响细胞内部的基因表达调控网络;
所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键,抗体不同和抗原结合能力也不同,是IP级别的抗体才能实验结果的可靠性;
交联与超声破碎是ChIP中难把握的部分,一般理想的超声破碎得到的片段大小是200bp-1000bp,不同的细胞类型可能会有适宜交联与超声条件上的差别;
为防止蛋白的分解、修饰,溶解抗原的缓冲液加蛋白酶抑制剂,低温下进行实验。
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