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详细内容

冰冻切片的**组化染色步骤

冰冻切片的**组化染色步骤

1.速冻组织 将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内(直径2cm),如组织块小可适当的加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时就开始气化沸腾,此时小盒保持原位不要浸入液氮内,大约10-20秒组织即立刻冰冻成块。

2.切片 取出组织冰块迅速置入-80℃冰箱留着备用,或置于恒冷切片机冰冻切片。冰冻切片4~8mm。

3.保存 冰冻切片后如不染色,吹干,储存低温冰箱内,或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。

4.固定 室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方6.式。

5.冲洗 PBS洗,5分钟×3。

6.内源性过氧化物酶的阻断 用3%过氧化氢孵育5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。

7.冲洗 PBS洗,5分钟×3。

8.以下接石蜡切片**组化染色操作步骤(滴加一抗开始)。

附石蜡切片**组化染色步骤

三步法(以SP试剂盒为例)

1. 石蜡切片脱蜡至水。

2. 蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,如需采用抗原修复,可在此步后进行。

3.3%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2分钟×3次。

4. 5~10%正常山羊血清封闭,室温孵育10分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

5.PBS冲洗,2分钟×3次。

6.滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或滴加**代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。

7. PBS冲洗,2分钟×3次。

8.滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或**代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。

9.PBS冲洗,2分钟×3次。

10. 显色剂显色(DAB或AEC)。

11.自来水充分冲洗,复染,脱水透明(如需要)、封片。

二步法(以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例)

1. 石蜡切片脱蜡至水。

2.蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,如需采用抗原修复,可在此步后进行。

3.3% H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2分钟×3次。

4.滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

5.PBS冲洗,2分钟×3次。

6. 滴加试剂1(Polymer Helper),室温或37℃孵育20分钟,PBS或TBS冲洗,2分钟×3次。

7. 滴加试剂2(poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG),室温或37℃孵育20~30分钟,PBS或TBS冲洗,2分钟×3次。

8. PBS冲洗,2分钟×3次。

9.显色剂显色(DAB或AEC)。

10自来水充分冲洗,复染,脱水透明(如需要)、封片。

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