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冰冻切片的免疫组化染色步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤
1.速冻组织 将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适当的加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时就开始气化沸腾，此时小盒保持原位不要浸入液氮内，大约10-20秒组织即立刻冰冻成块。
2.切片 取出组织冰块迅速置入-80℃冰箱留着备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。冰冻切片4~8mm。
3.保存 冰冻切片后如不染色，吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
4.固定 室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方6.式。
5.冲洗 PBS洗，5分钟×3。
6.内源性过氧化物酶的阻断 用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
7.冲洗 PBS洗，5分钟×3。
8.以下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。
附石蜡切片免疫组化染色步骤
三步法（以SP试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3.3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。
4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5.PBS冲洗，2分钟×3次。
6.滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加**代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
7. PBS冲洗，2分钟×3次。
8.滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或**代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
9.PBS冲洗，2分钟×3次。
10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
11.自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2.蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3.3% H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。
4.滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5.PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加试剂1（Polymer Helper），室温或37℃孵育20分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。
7. 滴加试剂2（poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG），室温或37℃孵育20~30分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。
8. PBS冲洗，2分钟×3次。
9.显色剂显色（DAB或AEC）。
10自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
