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上海达为科生物科技有限公司

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详细内容

Western blot简略实验步骤

材料:

1 PVDF膜为millipore公司,孔径为0.45um.,

2 过硫酸铵等试剂购自上海生工生物技术有限公司。

3 蛋白预染Marker购自碧云天公司。

4 显影粉,定影粉及X光胶片购自上海冠龙。

5,RIPA缓冲液含50mM Tris (pH7.4)150mM NaCl1% NP-400.5% sodium deoxycholate0.1% SDSsodium orthovanadatesodium fluorideEDTAleupeptin (碧云天公司),用时添加PMSF,终浓度为1mM

6,电泳缓冲液及丙烯酰胺(291)均购自上海迪生生物技术有限公司。其它试剂购自上海生工生物技术有限公司。

7,电泳仪,型号 mini protean 3 cell. BIORAD 公司。

8, 电转仪,PS-9,大连竞迈科技有限公司。

9,发光剂,ECLTM western bloting detection.,购自GE healthcare, 货号RPN2106

目的蛋白抗体名称

操作流程:

1 电泳:凝胶为12%聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白的每孔的上样量为40ug总蛋白。电压100V 15min120V恒压,1h 30min

 2 转膜:半干转,1h30min。 电转液为1L溶液含3.0g Tris14.4g 甘氨酸,200ml 甲醇。

 3 洗膜:PBS,洗涤5min,一次。

 4 加一抗,稀释液为含5%脱脂奶粉的PBST,稀释1400。4℃,一抗室温孵育2h

5 洗膜,PBST洗涤3次,每次5min

6 加二抗,抗兔HRP二抗,稀释液为含5%脱脂奶粉的PBST,稀释15000,室温摇晃2h

7 洗膜,PBST洗涤3次,每次5min

8 发光: 加发光剂,X光胶片曝光,压片约1min,显影。 

β-actin(内参蛋白)

操作流程:

 1 电泳:凝胶为12%聚丙烯酰胺凝胶电泳,浆蛋白的每孔的上样量为40ug总蛋白。电压100V 15min120V恒压,1h 30min

 2 转膜:半干转,1h30min。 电转液为1L溶液含3.0g Tris14.4g 甘氨酸,200ml 甲醇。

 3 洗膜:PBS,洗涤5min,一次。

 4 加一抗,β-actinabcam),稀释液为含5%脱脂奶粉的PBST,稀释110000。4℃, 一抗室温孵育2h

5 洗膜,PBST洗涤3次,每次5min

6 加二抗,抗鼠HRP二抗,稀释液为含5%脱脂奶粉的PBST,稀释15000,室温摇晃2h

7 洗膜,PBST洗涤3次,每次5min

8 发光: 加发光剂,X光胶片曝光,压片约30s,显影。

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