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大鼠骨髓来源的内皮祖细胞体外培养方法
日期：2024-05-01 11:19
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摘要：上海达为科生物科技有限公司，位于上海长江软件园，公司目前具备较好的生物学、医学技术服务平台，能够为广大客户提供医学科研样本检测、合作研究、开发及生产服务。 我们拥有专业的实验室、先进的实验设备和经验丰富的科研技术人员。技术团队包括研究员（博士后）2人，助理研究员（博士）4人，核心研究员（硕士）15人，致力于动物模型、动物实验、动物实验外包、整体实验外包，细胞实验、细胞实验外包、整体毕业课题等等。
1. SD大鼠，250g，通过颈椎脱位处死大鼠，浸入75%乙醇浸泡5分钟，转移到通风柜中的解剖盘中。
2. 打开皮肤，暴露、收集股骨，无菌状态下移除附着的肌肉和组织。
3. 并转移股骨至预冷含双抗的PBS中，洗涤三次。冰上操作。
4. 切断股骨骨骺， 使用5mlPBS，1ml注射器针头冲洗，冲洗液由棕色变成粉红色即可（股骨变白）。冲洗后，用1ml注射器吹打3-5次。
5. 70um滤网过滤，弃去筛网。使用 15ml 离心管，先加入分离液，然后缓慢加入滤过的悬液。20℃环境下，600g 离心 25min。
6. 离心后，离心管中液体由上至下分为四层。**层为稀释液层。**层为环状乳白色单个核细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。
7. 小心吸取离心管中的，环状乳白色单个核细胞层，转移到新离心管中，加入 5-10ml 洗涤液，混匀细胞。400g，离心 10min。
8. 弃去上清，用吸管吸取 5ml 清洗液重悬所得细胞。 250g，离心 10min，弃去上清。 再用M199完全培养基（含10 ng/mL VEGF，1 ng/mL b-FGF，1 ng/mL EGF，20%胎牛血清、1%双抗）清洗一次，弃去上清，M199完全培养基重悬细胞。250g，离心 10min，弃去上清。M199完全培养基重悬细胞，计数。
9. 按3×106/孔种入纤连蛋白包被过的24孔板，每3天换一次培养基，以去除非贴壁细胞，持续诱导培养2-3周。
