科研小白养细胞13问：你都遇到过吗？

  我时常说，养细胞就跟养孩子一样，不，我养孩子都不会这么用心的！次接过属于自己的细胞，那心情激动的，就跟捧着什么宝贝一样，刚复苏的时候恨不得一个小时看一次状态，**换一次液，看到一两个死细胞就想用PBS给它们清洗一下。。。。。。可想而知细胞会是什么鬼样子，所以分享一些养细胞以来的经验教训，欢迎各位一起讨论。

1、到底应该怎么样复苏细胞，才能细胞成活率高？

  我们常用的方法是准备一个37℃水浴锅、手套、镊子。戴上手套，用镊子夹住液氮罐中拿出的冻存管，然后在37-42℃水浴锅里融解细胞，这种条件下复苏的细胞，**天观察不能复活，但是70%-80%复活是没问题的。我想大部分同学都是用的这种复苏细胞的方法，但是发现，其实正确的复苏细胞的方法是：37度快速复苏是正确的，但由于DMSO的存在，直接在37℃下复苏细胞，会因为渗透压剧烈变化而使细胞“原地爆炸”。所以更好的做法是解冻到零度时（冻存管里还有一点冰）转移细胞至培养瓶或离心管中，然后用5ml热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后就可以补全剩余的培养基到细胞瓶里了。

  细胞复苏成活率低的原因可能有以下几种：a 培养基或血清质量差，b 复苏后立马离心，导致大量细胞炸成碎片，c 细胞长时间放置在-80℃，d 傻乎乎的误把悬浮细胞当做是死细胞。

2、细胞复苏后，是否应该马上离心，去掉DMSO?

  细胞复苏后其实不适合马上去离心，因为大部分细胞在冻存前用胰酶处理时，已经受到了很大的刺激，复苏时立刻离心相当于又接受了一次刺激，这样处理会让你的细胞“原地爆炸”，所以离心重悬这一步等几分钟再做，这样细胞存活率会很高。也有人建议复苏后的细胞（含有DMSO）加入培养基后培养，**后再换液，可以避免复苏后细胞的生长和粘附问题（不过自己还没有这么做过）。我们都知道DMSO在0℃以上便开始有毒性了，而不是4℃，当然4℃下操作也比在37℃下强多了。所以说，冻存时候理想的情况是在冰水混合物中混合细胞与冻存液，然后转移至冻存管里。现在很多公司已经生产出无需加DMSO的细胞冻存液了，这样处理对细胞的保存效果更好。复苏时，冻存管入水后应在水浴中直立，水面超过冻存细胞液面高度，然后牵着管子在水面缓慢浮泳或画圈，但不要振荡。

3、冻存管盖子裂开是什么原因？

  冻存管刚从液氮里拿出来的时候，用力不均很容易导致管子变形，导致管盖受力冻裂，你可以选择用镊子夹住。冻存管取出后管盖要拧紧，从液氮中取出后由于热胀冷缩，管盖很容易松动。这样复苏的时候，万一有漏液，在水浴锅里就会直接导致污染。同时，刚取出来的冻存管，你也要注意管内是否进入了液氮，应等挥发后再拧紧、入水，而不能直接拧盖，否则很容易爆炸。

4、细胞离心的转速应该是多少？

  一般来说国产离心机3000rpm离心3分钟，我们细胞间的离心机坏了，调不了转速，所以只能2000 rpm离心5分钟，反正问题也不大。更好的是用1000rpm离心5-10分钟，这样比较不容易伤害细胞。不过国产离心机的3000rpm未必能达到3000，所以问题并不大。

5、可以在养细胞的过程中更换培养基或者血清吗？

  千万千万别这么做，细胞就跟人一样，有的人爱吃辣，有的人爱吃甜，你把一个吃惯了东北菜的人扔到重庆，刚开始的一段时间，会满脸爆痘吧，养细胞也是这个道理。它们都有各自适应的培养基，万一更换培养条件，细胞可能无法快速适应，会导致细胞大量死亡。科研新手或者要养一种新的细胞，可以在ATCC官网查询这种细胞适应的培养条件；或者如果你是从别的实验室要来的细胞，可以咨询之前的人是用什么条件培养的。血清级别、培养基批次也是有讲究的，有些大实验室会一次性购买同一批次的培养基，排除培养基批次不同造成的影响。当然，如果你的老板很有钱，澳洲的血清是很好的，如果资金不允许，可以备着一些少量的别血清，以防细胞状态不好的时候急救用。

6、细胞需要多久换液？

  这个要根据细胞的生长状态来定，当细胞代谢加快后，应该换液。细胞密度增大后，需要考虑传代。而且我发现，不同的季节细胞生长速度也不同（我也搞不懂这一点，虽然一直在培养箱里待着）

7、培养基到底要不要加***？

  我看过有人说其实是不推荐加***的，但是很多时候，都会为了保险，会加上双抗。但是要知道双抗只能抗**，不能抗**！

8、什么时候用5%的CO2，什么时候用10%的CO2呢？有差别么？

  是有差别的，主要看你的培养体系，培养基的缓冲体系基本上都是碳酸氢钠缓冲体系，培养基里的碳酸氢钠的浓度决定了CO2的量。当碳酸氢钠达到3.7g/L的时候，需要采用10%的CO2；当碳酸氢钠达到1.5g/L的时候，需要用5%的CO2。如果你用的培养基用的是Hank'sbalanced salt solution (HBS，Hank缓冲液)的话，就不能用CO2培养箱了哦，因为这个体系里碳酸氢钠浓度只有0.35g/L。

9、培养基在冰箱里的时候，紫红色的培养基为啥会变暗？

  这个问题就很简单了，因为冰箱里没有5%的CO2，培养基变成碱性，当然颜色就变了。

10、怎么判断细胞是否是支原体污染？ 

  我还没有遇到过这种问题。这个是我自己查到的，仅供参考。一般来说，污染了支原体的细胞，生长状态会变差，用肉眼基本很难判别到底是支原体污染还是你自己培养的时候在培养基里多加了一把盐……主要还是通过PCR检测或者是染色检测来区分支原体污染与否的。不过一旦污染，尽量丢弃，然后查看你的血清是否**。

11、细胞铺板的时候怎么控制细胞的量？

  这个真的是需要个人操作经验了。一般情况下，我们会先用牛鲍计数板进行细胞计数，然后再进行稀释。但是个人操作对牛鲍计数板的影响实在是太大了（至少我在这一点的用的不是很好）。大部分需要细胞铺板的实验，比如细胞划痕实验，都是想让细胞铺满的，如果刚开始量很少，细胞就会长的很慢很慢，慢到绝望。而且在这个过程中，也会影响到细胞的形态。

12、如何避免细胞培养过程中的污染？

  我觉得，我一进细胞间，就提起了12万分的精神，一个实验室共用一个细胞间，无菌操作敲黑板的重要。主要还是考虑无菌环境，尽量做好操作台的**。你要是在培养箱里把培养基打翻，那就闯大祸了，这地方霉菌一旦滋生，那你就只能等着用甲醛熏蒸了，因为紫外无法杀灭霉菌，酒精也不行，只能用火，复苏的时候，水浴锅也是需要进行**处理的。一旦出现污染，就只能扔掉，game over了。

13、为什么胰酶里要加EDTA？

  并不是所有的细胞都需要胰酶消化的，胰酶消化后的细胞由于自身内部的细胞骨架张力以及培养液表面张力作用下成为球形。一般消化时间1-3min（具体的消化时间也要看胰酶配制的时间长短。放置时间较长的胰酶，消化效果会减弱，消化时间会加长），镜下肉眼观察皿底由半透明细胞单层连接成片转为点状透明（出现细小空隙），并加入适量培养基，终止消化，吹打分散。EDTA作为一种螯合剂，可以结合Ca、Mg这样的二价离子。单纯胰酶和单纯EDTA都可以消化细胞。胰酶中加入EDTA做消化液，是联合了两种消化方法。由于培养基无法终止EDTA的消化作用，所以还需要用适量的PBS终止EDTA反应，以防影响细胞贴壁情况。

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