抗体杂交

一、抗体杂交实验目的及原理

  利用抗原、抗体特异结合作用使结合于膜上的目的蛋白被一抗、二抗特异性标记。

二、抗体杂交实验试剂及器材

  结合有蛋白质分子的NC膜或PVDF膜，一抗及二抗，去离子水，1%丽春红染剂，Tween-20，Tris碱，Nacl,脱脂奶粉，剪刀，6cm平皿，平头镊子，移液器，封口机，避光盒，塑料袋。

三、抗体杂交实验步骤

1、配制TBST缓冲液，配方附后。

2、将转膜夹子从转膜装置中取出，打开，用平头镊子将NC膜或PVDF膜移入装有1%丽春红的平皿中，染色30s或更长时间，此时应看到膜上有整齐的粉红色蛋白条带，蛋白Marker泳道只有标定分子量的蛋白条带，用圆珠笔标记Marker泳道的蛋白条带，剪去多余的部分。

3、将标记好Marker、剪裁好的膜移入装有TBST缓冲液的平皿中，摇床设定为80rpm，洗去染在膜上的丽春红，洗涤期间适时更换TBST缓冲液。洗约5-10min。

4、用TBST配制含5%脱脂奶粉的封闭缓冲液40ml,将洗去丽春红的膜移入装有封闭缓冲液的平皿，摇床设定为60rpm，室温条件封闭1h。

5、使用TBST配制适当稀释度的一抗封闭缓冲液，将经过脱脂奶粉封闭的膜置入一合适大小的干净的塑料袋中，加入配好的一抗缓冲液，封口机封口，摇床设定为60rpm，室温条件封闭1h。采用封口机封口时注意塑料袋在横轴和纵轴方向上压膜封口时皱褶程度不同，尽量将NC膜长轴与皱褶程度小的方向摆放一致，压膜的电压适当选择好，压膜时间要在封口机红灯熄灭后再压5-6s开启，可以减少皱褶及渗漏机会。这些虽然是细节，但是掌握不好却可以影响整个实验效果。

6、装有膜的塑料袋保持平整地放置于4℃冰箱中，使NC膜各处均有一抗接触，放置过夜。

7、从冰箱中取出装有膜的塑料袋，剪开口，用平头镊子将膜取出，置于装有TBST的平皿中，洗涤，摇床设定为80rpm，洗3-4次，每次5-10min。

8、使用TBST配制适当稀释度的辣根过氧化酶标记的二抗封闭缓冲液，将洗过的膜置入一合适大小的干净的塑料袋中，加入配好的二抗缓冲液，封口机封口，摇床设定为60rpm，室温条件封闭1h。

9、接7，亦可选用荧光素标记的二抗，同样使用TBST配制适当稀释度的二抗封闭缓冲液。此时应将二抗封闭缓冲液装入可以遮光的盒子，以避免荧光淬灭。将膜置于盒子中，摇床设定为60rpm，室温条件封闭1h。

10、接8，将二抗封闭后的塑料袋剪开口，用平头镊子将膜取出，置于装有TBST的平皿中，洗涤，摇床设定为80rpm，洗3-4次，每次5-10min。留待发光检测。

11、接9，将膜仍置于遮光的盒子中，用TBST洗涤，摇床设定为80rpm，洗3-4次，每次5-10min。留待仪器扫描。

四、结果分析

  抗体封闭好坏直接关系到后续的结果，封闭良好时可获得清晰、特异的结果，否则将得到模糊、杂乱、高背景的结果。

五、注意事项

1、配制TBST缓冲液时，要认真调节pH值，缓冲液pH值范围为7.4-7.6。

2、注意标记膜上的Marker条带及膜的上下角，记清每一个标记所代表的蛋白分子量大小，分清膜的前后面及上下左右。标有Marker一面为正面。

3、封闭缓冲液也可使用牛血清白蛋白配制，除非牛血清白蛋白中含有目的蛋白。

4、刚在脱脂奶粉中封闭完的膜先在TBST缓冲液中泡一下再封闭一抗。

5、确定封有膜的塑料袋没有渗漏，否则极可能后没有结果。

6、膜在封闭抗体时保持平整，避免外界因素造成蛋白结合抗体不均匀。

7、使用荧光二抗时要避光操作，并注意荧光二抗的保存期限，一般4℃可保存2周。

六、个人心得

1、可预先配制10×TBS，使用时稀释至1×TBS，并加入相应量的Tween-20。

2、丽春红染色后，膜上没有着色或着色很淡：检查1%丽春红是否使用过久，可重新配制1%丽春红再染色；转膜失败，转膜时某一步电极接反；转膜失败，转移缓冲液成分有问题，如甘氨酸质量过低。

3、丽春红染色后，膜上可见圆圈状白斑：组装转膜夹子时气泡没有赶出。若圆圈位于目的蛋白所在，则转膜失败。

4、丽春红染色后发现蛋白条带之间距离过近：电泳时蛋白没有充分分离，可能为下层胶浓度过低或配制下层胶的Tris-HCl没有按规定调节pH值。

5、脱脂牛奶封闭时，注意所用奶粉充分溶解成乳浊液。过期奶粉在溶液中呈颗粒状，不能用于封闭。

6、抗体可以回收使用，加入叠氮钠后保存时间可延长，推荐重复使用次数不超过3次，效果特别好的内参照蛋白抗体例外。

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