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细胞冻存实验技术
一、基本原理及实验目的
细胞冻存是通过向培养液中加入保护剂，减少冻存过程中细胞内冰晶形成，来保护细胞，是保存细胞的基本方法。
二、主要仪器及试剂
1、0.25%胰蛋白酶：称取胰蛋白酶粉末0.25g，加入100ml PBS，充分溶解后过滤**备用，4℃保存。
2、含20%胎牛血清的培养液：将培养液和胎牛血清按4:1比例混合，过滤**备用，4℃保存。
3、细胞冻存液：含20%胎牛血清的培养液和DMSO按照9:1比例混合，备用。
4、弯头滴管、移液器及枪头、冻存管等。
三、操作步骤（以贴壁生长的细胞为例）
1、取对数生长期的细胞，当细胞增殖至培养瓶底（25cm2培养瓶为例）80%时，用弯头滴管吸出培养基。
2、加入1ml胰蛋白酶，洗涤1次后弃去瓶中液体。
3、重新加入1ml胰酶，消化细胞。
4、倒置显微镜下观察，当细胞变圆并有部分细胞脱壁后，加入1ml含有血清的培养基终止消化。
5、用滴管吸取瓶中液体轻轻吹打培养瓶底，使细胞脱壁。
6、将细胞悬液移入离心管，800rpm离心5min。
7、弃去离心管中液体，加入培养基2ml，用滴管轻轻吹打，使细胞重悬。
8、800rpm离心5min。
9、用滴管吸去离心管中液体。
10、加入1ml细胞冻存液，重悬细胞。
11、将细胞悬液移入冻存管中，4℃放置30min。
12、-20℃放置2h，-70℃过夜。
13、放入液氮中保存。
四、结果判读
判断细胞冻存的好坏，需要看复苏后，细胞的贴壁率及细胞状态。若复苏后细胞95%以上贴壁，而且细胞状态良好，这就说明细胞冻存的过程没有问题。
五、注意事项
1、所有的细胞实验中均需要注意无菌操作。
2、细胞冻存的过程，降温的速率要小。过快地降温，会因细胞内形成冰晶而使细胞死亡。
3、冻存的细胞要做好名称和日期等标记。
六、实验心得
在细胞冻存前，要观察细胞的状态，细胞状态的好坏直接决定了复苏后细胞的生长情况。在冻存的前**需要给细胞换液，细胞冻存前有足够的营养，以保持很好的细胞增殖状态。对于增殖比较旺盛的细胞，在冻存时可以用相对较小的浓度，一般情况下，长满一个25cm2培养瓶的细胞冻存一支就够了。对于增殖比较缓慢的细胞，一般长满两个25cm2培养瓶的细胞冻存一支。
对于一些原代细胞来说（如某些正常细胞），冻存的效果可能不会太好。在实验的过程中我们发现，配制冻存液的时候，用含10%胎牛血清的培养液或者含20%胎牛血清的培养液或者纯血清，好像对细胞的影响并不是很大，但是如果DMSO的浓度高于10%，将会对细胞产生很大的毒性。如果细胞只是短期内不用（3个月以内），将细胞冻存在-70℃冰箱中即可；若长期不用，建议还是将其保存在液氮中。对于悬浮生长的细胞，省去胰酶消化环节，直接收集细胞悬液，离心即可。另外，操作细胞前，建议将培养基和胰酶平衡到室温或37℃，以减小对细胞的影响。
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