荧光定量PCR

一、荧光定量PCR基本原理及实验目的

荧光定量PCR通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而对起始模板定量及定性的分析。

实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。

由于SYBR Green I可结合所有的双链DNA，因此不必因模板的不同而特别定制，且价格相对较低。然而，扩增产物的特异性是准确定量所必需的。通过分析扩增产物的熔点曲线可以判断是否存在非特异性扩增，并进一步调整引物浓度或设计新的引物序列来避免非特异性扩增产物。

二、荧光定量PCR试剂配制

已有很多商品化的PCR反应试剂（Master Mix）,包括dNTP、Mg2+、Taq酶、SYBR Green I染料和ROX染料（用来校正加样误差）、这些Master Mix往往被制成2倍浓缩液，实验者用时只需加入总反应体积一半的Master Mix液，然后加入引物和模板即可。

PCR反应所需的试剂均须用无RNase和DNased的水稀释。

三、荧光定量PCR实验步骤

    1. 引物的设计与合成

（1）相关文献检索 可检索所需检测基因的相关文献，查看是否已有公开发表的针对目的基因的用于定量PCR反应的扩增引物序列和反应条件。

（2）网站查询 如无文献提供，则查看以下三个网站是否有已经证实的适用于定量PCR的扩增引物，探针以及反应条件。

http://medgen.ugent.be/rtprimerdb

http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html

http://www.realtimeprimers.org

（3）自己设计 如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考，以下的设计原则可供参考：

①上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58℃-62℃之间，上下游引物的Tm值相差尽量不超过2℃。

②引物中GC含量在30%-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现。引物的3'端尽量不为G或（和）C。引物3'端的5个碱基不应出现2个G或（和）C。

③避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。

④跨外显子设计引物，用于区别或消除DNA的扩增。

    2. 提取组织或细胞的RNA 具体操作步骤同前。为了扩增效率，使定量结果更准确可靠，用于定量PCR的RNA要求有更高的纯度，A260/A280的比值要在1.8-2.0之间。

    3. 将提取的RNA反转录成cDNA 反转录步骤同前。

    4. PCR条件的优化 衡量所用反应条件是否适合，主要是通过查看扩增曲线和反应产物的特异性来确定。扩增曲线呈典型的S型扩增，且曲线平滑，说明模板状况良好。是否有引物二聚体等非特异性扩增可通过融解曲线和琼脂糖凝胶电泳来确定，融解曲线只呈现一个峰则说明扩增产物为特异性的。此外，下列参数的优化有利于找到合适的反应条件：

①模板的浓度：如果是进行次实验，实验者应通过选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选择出合适的模板浓度。一般而言，使所扩增的曲线进入指数扩增的循环数介于15-30个循环，若大于30，则应使用较高的模板浓度，如小于15，则应选择较低的模板浓度。

②引物的浓度：引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，若浓度太低，会致使反应不；若引物太多，则发生错配以及产生非特异性的产物的可能性会大大增加。对于大多数PCR反应，0.3umol/L是个合适的浓度，若选用这个浓度不理想，可在0.1-1.0umol/L之间进行选择。此外，上下游引物的浓度也可根据需要调整，不相同。

③退火温度：次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5℃，然后在1℃-2℃内进行选择。一般的，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到的Tm值有的差距。

    5. PCR反应体系的制备 反应体系通常为25ul:

2×SYBR Master Mix:12.5ul

引物：100-1000nmol/L

cDNA:10-50ng

补水至25ul

将针对同一基因的除模板外的扩增试剂混合，然后等量加入每个反应管中，针对每个基因的每个样品要有三个重复扩增管，然后向每管加入稀释好的模板。

    6. 实时检测和定量扩增的产物 将加样后的96孔板用透明贴膜密闭，放入PCR仪中，设置好反应条件，进行扩增。

四、结果分析

基因表达调控研究中，常用的相对定量方法主要有两种，Delta-deltaCt法和双标准曲线法。这两种方法都至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因，以校正RNA纯化后得率不同，RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素。常用的看家基因有beta-actin(β-肌动蛋白)、GAPDH、18SrRNA等。因此，我们分别来看看以上两种相对定量分析方法的特点和应用。

    1. 相对双Delta Ct法（Comparative Delta-delta Ct法）公式：2-△△Ct。由Delta-delta Ct的公式可以看出，该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默认两个基因扩增效率一致。

Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用：

①Comparative Delta-delta Ct法的一大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无须再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。

②每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存在的偏差。

用Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，对目的基因和看家基因做两组标准曲线。如果两组标准曲线斜率的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。反之，差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其他的相对定量方法。

    2. 双标准曲线法 双标准曲线法考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率。

双标准曲线法的特点，注意事项及实际应用：

①双标准曲线法做相对定量分析的特点是，应用简便，无须像Comparative Delta-delta Ct法那样对实验进行严格的优化。

②其不足之处是每次实验都对目的基因和看家基因做两组标准曲线。

并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA,那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在误差。

每种相对定量方法都会有的局限性，对于双标准曲线法，比较适合于样本量不大、但研究的基因较多的客户，这样对不同基因条件优化相对Delta-delta Ct法更为简单。

五、荧光定量PCR注意事项

    1. 在制备反应液的过程中操作者要戴手套，以避免污染。在用贴膜密闭96孔板时，由于定量PCR仪对荧光信号的采集是通过96孔板上面来进行的，因此用污染的手套或直接用手指接触96孔板上面，都可能产生非特异性荧光信号，干扰后续的分析工作。

    2. 使用的加样枪须经过校准。

    3. 减少小体积操作。

    4. 将反应液加入到检测用的反应孔板中时，避免产生气泡。

    5. 防止试剂交叉污染，特别是模板与其他反应用的液体应隔离储存。

    6. 引物和模板长期应置于-20℃保存，防止降解。

    7. 含有SYBR Green I和ROX等染料的反应混合液应避光保存。