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单克隆抗体及杂交瘤细胞的筛选

杂交瘤细胞筛选

杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选,即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来,通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多,通常根据所研究的抗原和 实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便,便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报 告结果,以便决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来,在融合之前就必须建立好抗体检测 方法,并克服可能存在的问题。另一个重要问题是抗体检测方法所需要的“动力学范围”,即检出背景以上的最强与最弱信号之比,依所用的检测抗原是否纯净而 定。如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的,100%的抗原参与反应,一个阳性/阴性判别系统就够了。另一方面,如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白 抗原,检测系统可能需要能测出微弱信号,则动力学范围至少应为10:1,最好为100:1。另外,检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的 影响。结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出。如需结合A蛋白的杂交瘤抗体,就要用结合蛋白A的检测方法。

杂交瘤细胞的克隆化

从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞,可能来源于二个或多个杂交瘤细胞,因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体,必须对杂交瘤细胞进行克隆化。另一方面,杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的,有的细胞丢失部分染色体,可能丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已不再分泌抗体的细胞,得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系(又称亚克隆),也需要克隆化。另外,长期液氮冻存的杂交瘤细胞,复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失,因此也应作克隆化,以检测抗体分泌情况。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化,有时还需进行多次。所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团 体的整个培养过程。克隆化的方法很多,如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪(FACS)。

杂交瘤细胞的冻存与复苏

(1)杂交瘤细胞的冻存。在建立杂交瘤细胞的过程中,有时一次融合产生很多“阳性”孔,来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作,需要把其中一部分细胞冻存起来;另一方面,为了防 止实验室可能发生的意外事故,如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难,通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子,以 免遭到不测。在杂交瘤细胞建立以后,更需要冻存一大批,以备今后随时取用。

(2)杂交瘤细胞的复苏。杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存,若无意外情况时,可保存数年至数十年。复苏时融解细胞速度要快,使之迅速通过最易受损的-5℃—0℃,以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。


单抗特性的鉴定

⑴单克隆性的确定 包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。

⑵单抗理化特性的鉴定。从实用意义上说,单抗对温度和PH变化的敏感性以及单抗的亲合力都是理化特性鉴定的主要项目,它们可为单抗的使用和保存提供重要依据。

⑶单抗与相应抗原的反应性测定。单抗与相应抗原的反应性决定于它所识别的抗原表位,确定单抗针对的表位在抗原结构上的位置,是单抗特性鉴定的关键环节,同时,进一步分析这类表位的差别, 可正确评价单抗的特异性和交叉反应性。特点

一是特异性,针对特定的单一抗原表位,它具有高度的特异性,抗肿瘤抗体药物的研究表明,其特异性主要表现为特异性结合、选择性杀伤靶细胞、体内靶向性分布以及具有更强的疗效。

二是多样性,主要表现在靶抗原的多样性、抗体结构的多样性、作用机制的多样性等方面。

三是定向性,抗体药物可以定向制造,就是根据需要制备具有不同治疗作用的抗体药物。基于这些特点,我们可以用来制成“生物导弹”运送药物至病害部位,主要是癌细胞,从而达到治疗效果。


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