1. 准备工作

俗话说用欲善其事，必先利其器。我强烈建议大家在做构建之前先找好工具，这样起的效果事半功倍。这里推荐大家两个工具，一个都知道，PRIMER5.0。另一个工具极强大，叫lasergene，包括设计引物到构建图谱一应俱全，图谱非常漂亮，而且分析酶切位点等等就超NB。

2. PCR
如果没有现成的质粒可供酶切，PCR是理想也是方便的策略。

PCR产物的纯化
如果带很单一，又强，直接PCR产物纯化就可以，如果有杂带，但目的带也很强，跑胶，目的带切胶回收。回收这里也有个瓶颈，就是回收率的问题，我试过很多家的KIT，promega的GEL回收试剂盒效率和价格都很合适，推荐这个。
关于T载体，我在国内的时候是必用的，到了美帝反倒一次没用过，这边比较流行直接用PCR产物切，就是回收完了直接切上，回收后然后连接，这又回到了开始设计，要加保护碱基。这个策略好处就是免除了T载体这步，直接插入目的载体，存在的问题就是处于盲做状态，还要加保护碱基。
3. 酶切
我的原则一向是：尽量避免PCR，能酶切的多酶切，实在没办法才去PCR。
这里强烈推荐NEB的内切酶，还记得在有一次用别家的酶切过夜，结果质粒都被切碎了（当然当时质粒浓度也不高），而用NEB的酶，切个七十二小时仍旧一切OK，尤其现在NEB还推出了HF的内切酶，没有星活性而且统一都用Buffer4，很好用，在国内我都用TAKARA的酶，基本上还可以。
注意要读说明书，选用什么buffer，多少度，用不用加BSA，这些都要仔细读。
酶切的起始量，PCR产物没甚么可说的，全都切上，如果是从质粒上切片段，要根据你片段大小，片段适中，比如说7kb质粒，有2KB是目的片段，这时切个3-4ug就足够了，如果只有0.2KB,那好多切点，6ug-7ug　内切酶也没问题。
4. 连接
常用的是NEB的T4和Promega的T4,都很好用，但是注意Buffer里有ATP，反复冻融ATP失活得很快，这时有两种办法，一种是象我们chair实验室，每次连接都统统朝里面加1uL ATP;另一种是我们实验室的策略，拿到buffer就分装，10uL/管，一次性使用，哪怕就用1uL，剩下的直接扔掉。连接重要的注意事项，1，载体总量，2.载体和插入片段比例，3.载体和插入片段质量。
5. 转化
这个简单遵循基本的准则就行，话说实验室原来从sigma买感受态（competent cell），后来发现还是自己做的效率高，尤其在使用XL-10**的时比DH5a效率要高，需要的话我可以发protocol上来。要注意的是LB无菌而且没有***，实验室原来有个volunteer，做一次失败一次，我就奇怪了，后来才发现他用的居然是加了KANA的LB，直接晕过去了。还有就是氯化钙的问题。氯化钙吸水性很强，吸水后就完蛋了，我一般把它放在干燥罐里（反正我也不知道啥名字，就那种玻璃罐，干燥用的），大家要不放心，用之前可以把氯化钙放在烘箱里烤一烤。
6. 鉴定
普通实验做酶切鉴定，阳性率非常高，大多数情况下四个中起码有三个是正确的，很多时候都是***正确，这里推荐一种叫fast digest的酶，切个十几分钟跑胶就行了。
如果找不到合适的酶切位点或者有其他问题，比方说有段时间我做个非常新潮的实验，初始步骤的虽然是蓝白筛选，但是白斑也大部分都不对，没办法鉴定就用菌液PCR，夸张的一次是五十个白斑里面居然就一个阳性的（没办法，该实验特点），这要提质粒可提不起。菌液PCR也有讲究，很多人做菌液PCR鉴定假阳性特多，为甚么？因为你PCR引物选的都在载体上，注意，引物分别在载体和插入片段上才准，PCR方法鉴定是极其准确的。

7. 测序
我们拿到测序结果时候，不仅要核对具体的序列，而且要看测序图，这很重要，因为有时候光看结果对，实际上图显示的不对，或者虽然结果不对，但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信，出现突变也不怕，有很大可能性是简并密码子，还要重点检查的地方就是“接头”的地方，因为偶尔引物会出错，比方说少个碱基什么的，还有时候酶切之后连接也会丢一或者俩碱基什么的（这些问题我都碰到过），如果不仔细检查到了后期悔之无及。