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载体构建及心得分享

1. 准备工作

俗话说用欲善其事,必先利其器。我强烈建议大家在做构建之前先找好工具,这样起的效果事半功倍。这里推荐大家两个工具,一个都知道,PRIMER5.0。另一个工具极强大,叫lasergene,包括设计引物到构建图谱一应俱全,图谱非常漂亮,而且分析酶切位点等等就超NB

2. PCR
如果没有现成的质粒可供酶切,PCR是理想也是方便的策略。

PCR产物的纯化
如果带很单一,又强,直接PCR产物纯化就可以,如果有杂带,但目的带也很强,跑胶,目的带切胶回收。回收这里也有个瓶颈,就是回收率的问题,我试过很多家的KIT,promega的GEL回收试剂盒效率和价格都很合适,推荐这个。
关于T载体,我在国内的时候是必用的,到了美帝反倒一次没用过,这边比较流行直接用PCR产物切,就是回收完了直接切上,回收后然后连接,这又回到了开始设计,要加保护碱基。这个策略好处就是免除了T载体这步,直接插入目的载体,存在的问题就是处于盲做状态,还要加保护碱基。
3. 酶切
我的原则一向是:尽量避免PCR,能酶切的多酶切,实在没办法才去PCR。
这里强烈推荐NEB的内切酶,还记得在有一次用别家的酶切过夜,结果质粒都被切碎了(当然当时质粒浓度也不高),而用NEB的酶,切个七十二小时仍旧一切OK,尤其现在NEB还推出了HF的内切酶,没有星活性而且统一都用Buffer4,很好用,在国内我都用TAKARA的酶,基本上还可以。
注意要读说明书,选用什么buffer,多少度,用不用加BSA,这些都要仔细读。
酶切的起始量,PCR产物没甚么可说的,全都切上,如果是从质粒上切片段,要根据你片段大小,片段适中,比如说7kb质粒,有2KB是目的片段,这时切个3-4ug就足够了,如果只有0.2KB,那好多切点,6ug-7ug 内切酶也没问题。
4. 连接
常用的是NEB的T4和Promega的T4,都很好用,但是注意Buffer里有ATP,反复冻融ATP失活得很快,这时有两种办法,一种是象我们chair实验室,每次连接都统统朝里面加1uL ATP;另一种是我们实验室的策略,拿到buffer就分装,10uL/管,一次性使用,哪怕就用1uL,剩下的直接扔掉。连接重要的注意事项,1,载体总量,2.载体和插入片段比例,3.载体和插入片段质量。
5. 转化
这个简单遵循基本的准则就行,话说实验室原来从sigma买感受态(competent cell),后来发现还是自己做的效率高,尤其在使用XL-10**的时比DH5a效率要高,需要的话我可以发protocol上来。要注意的是LB无菌而且没有***,实验室原来有个volunteer,做一次失败一次,我就奇怪了,后来才发现他用的居然是加了KANA的LB,直接晕过去了。还有就是氯化钙的问题。氯化钙吸水性很强,吸水后就完蛋了,我一般把它放在干燥罐里(反正我也不知道啥名字,就那种玻璃罐,干燥用的),大家要不放心,用之前可以把氯化钙放在烘箱里烤一烤。
6. 鉴定
普通实验做酶切鉴定,阳性率非常高,大多数情况下四个中起码有三个是正确的,很多时候都是***正确,这里推荐一种叫fast digest的酶,切个十几分钟跑胶就行了。
如果找不到合适的酶切位点或者有其他问题,比方说有段时间我做个非常新潮的实验,初始步骤的虽然是蓝白筛选,但是白斑也大部分都不对,没办法鉴定就用菌液PCR,夸张的一次是五十个白斑里面居然就一个阳性的(没办法,该实验特点),这要提质粒可提不起。菌液PCR也有讲究,很多人做菌液PCR鉴定假阳性特多,为甚么?因为你PCR引物选的都在载体上,注意,引物分别在载体和插入片段上才准,PCR方法鉴定是极其准确的

7. 测序
我们拿到测序结果时候,不仅要核对具体的序列,而且要看测序图,这很重要,因为有时候光看结果对,实际上图显示的不对,或者虽然结果不对,但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信,出现突变也不怕,有很大可能性是简并密码子,还要重点检查的地方就是“接头”的地方,因为偶尔引物会出错,比方说少个碱基什么的,还有时候酶切之后连接也会丢一或者俩碱基什么的(这些问题我都碰到过),如果不仔细检查到了后期悔之无及。


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