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Western blot,内参蛋白选用技巧!


一、Western Blot实验为什么要用内参?

Western Blot实验结果进行内参校正已成为一种惯例。目的蛋白表达量的相对多少,前提条件是等量的组织细胞蛋白上样,才有比较的基础,特别是表达量不高时,上样量的的差别就很有可能影响结果的分析。因此,在Western Blot试验中,进行内参的检测,有以下两点作用:

 

1、校正蛋白质定量、上样过程中存在的误差,实验结果的准确性;

2、使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否、整个Western Blot显色发光体系是否正常。

 

二、你的内参选对了吗?

作为内参的蛋白要符合的标准,可从以下几方面入手:

1、要考虑的就是实验样本来源于什么物种。

样本来源

选择内参

哺乳动物组织或细胞

β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K atpase等

植物来源

plant actin、Rubisco

其他来源样本研究较少

应参照文献报导,选择合适的蛋白作为内参。

 

2、内参的检测带与那些目标蛋白的检测带在分子量上有所不同;

选择内参抗体时,应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量为45KD,此时不适宜选择β-actin作为内参,可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。

 

针对不同样品制备常用的内参以及它们的分子量

3、要考虑目的蛋白表达部位

就一般的蛋白检测来说,β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了,而针对于核蛋白的定量,特别是样本蛋白就是核蛋白时,选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3,除此之外,其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等,在一些文献报道中,Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测,常用的内参抗体为Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测,常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

 

4、实际的实验环境

有些细胞在某些条件下内参表达会出现异常,使其不适合做内参。

①某些细胞中,由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高,不适合做内参。

②在凋亡实验时,Lamin等也不适合作为内参。

③在加入**和抗****时,Tubulin的表达易受影响,不适合作为内参。

④Lamin B不适合作为胚胎干细胞的内参,而PCNA不适合作为非增殖细胞的内参等。其他具体可查询相应文献。

 

5、不同的组织特异性

actin 即肌动蛋白,是细胞的一种重要骨架蛋白。actin 大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的,在肌肉组织中beta-actin分布就很少,心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参。

 

三、实验中使用内参的方法你知多少?

Western Blotting实验过程中使用内参的方法通常有以下三种。

1、超级简便的标记内参使用法,只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体,按照正常操作即可;

 

2、普通内参,当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时,可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测,然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体,重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。

 

3、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下,可以在转膜后预染,根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分,使内参蛋白与目的蛋白分开,然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育,二抗温育以及显色。

 

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