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免疫荧光注意的细节
日期：2024-04-20 21:18
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摘要：
免疫荧光方法中的重要环节及注意事项
1、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构可能破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。
2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定 5-10 min，尤其要较长时间保存的白片，要及时固定和适当保存。
3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般 10-30 min。
4、一抗孵育条件...
免疫荧光方法中的重要环节及注意事项
1、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构可能破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。
2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定 5-10 min，尤其要较长时间保存的白片，要及时固定和适当保存。
3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般 10-30 min。
4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃ 、室温、37℃ ，其中 4℃ 效果佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 37℃ 1-2 h，而 4℃ 过宿和从冰箱拿出后 37℃ 复温 45 min。具体条件还要摸索。
5、二抗孵育条件：二抗一般室温或 37℃ 立即观察，若将标本放在聚乙烯塑料袋中 4℃ 30 min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩还要摸索浓度液，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。后，免疫荧光中荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。
6、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用 DAPI 复染。
