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**荧光注意的细节

**荧光方法中的重要环节及注意事项

1、冰冻切片制备:建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构可能破坏,易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织要冷冻适度等,防止裂片和脱片严重。

2、组织切片固定:切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定 5-10 min,尤其要较长时间保存的白片,要及时固定和适当保存。

3、血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源致)封闭,减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的,一般 10-30 min

4、一抗孵育条件:在**组化反应中重要,包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4℃ 、室温、37℃ ,其中 4℃ 效果佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般 37 1-2 h,而 4℃ 过宿和从冰箱拿出后 37℃ 复温 45 min。具体条件还要摸索。

5、二抗孵育条件:二抗一般室温或 37℃ 立即观察,若将标本放在聚乙烯塑料袋中 4 30 min-1h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,若是浓缩还要摸索浓度液,切记要避光反应。但在**荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。后,**荧光中荧光素标记的二抗随着保存时间的延长,可能后有大量的游离荧光素残留,需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。

6、复染:目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用 DAPI 复染。

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