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什么时候需要用到稳定细胞株

 一、什么时候需要稳定细胞株?

以下实验中,构建稳定细胞株而不是瞬时转染更能满足实验要求:

1、外源片段在分裂细胞中长期(>2周)稳定表达。虽然普通转染实验一般只能保证2-4天的转染和表达效率,但腺病毒载体在多数分裂细胞中可以维持2-4周内的高转染效率和表达周期。而非分裂细胞,可以使用腺相关病毒载体转导外源基因,因为腺相关病毒载体在许多非分裂细胞中可以保持长达1年的高效表达。

2、需要构建使用诱导表达系统,这主要是由于:a),过表达基因或者干扰目的基因引起细胞毒性或者抑制细胞生长等不利因素;

3、目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性。

4、希望控制目的基因过表达或者干扰的拷贝数,以避免引入人为因素影响实验结果的精确性。构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究。

5、部分细胞种类,病毒载体亦无法达到高转导效率,通过构建稳定株,达到外源片段的高效表达。

6、长期在少数几类细胞中研究几个基因的功能,通过构建稳定株,可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本,也极大方便实验研究。

7、部分蛋白稳定性极强,瞬时RNA干扰因为作用周期短,只能抑制目的基因的表达,但无法去除已经表达的目的蛋白,所以需要通过构建稳定株实现更好的基因干扰效果。

8、需要往动物体内注射表达有外源片段的细胞。需要构建稳定细胞株,以防止注射入动物体内后,很快外源片段表达丢失。

9、细胞个体差异(同一类细胞,不同个体细胞基因组存在差异)对实验结果有干扰,需要构建单克隆细胞株去除干扰。

10、需要将外源片段插入基因组中,比如基因敲除,基因插入突变筛选等修饰基因组的实验。

二、什么时候不需要构建稳定株?

1、希望迅速观察目的基因过表达或者干扰效果。例如在正式实验之前进行的小规模预实验。

2、2-4天的瞬时表达已经可以达到具体的实验目的,比如检测两个外源转染的目的蛋白之间的相互作用,或者观察某些细胞周期抑制,凋亡或细胞存活相关基因的细胞表型。

3、细胞个体差异对实验结果有影响。体外培养非原代细胞,多为转化细胞系或者癌细胞,细胞个体差异大,瞬时转染或者使用腺病毒/腺相关病毒载体进行转导更可以反映细胞群体行为。或者使用逆转录病毒载体构建混合稳定株。

三、 病毒载体构建稳定细胞株有什么优势?

化学试剂介导的转染方法和电转,整合率低,同时整合位点不稳定,易发生再次丢失的情况,而且整合位点一般都在转录活跃区之外,所以并不是理想的稳定整合工具。另外,整合后的拷贝数是由核内的外源DNA局部浓度,而不是转染时的DNA的量决定,而化学方法在输入质粒载体入核的效率比电转和病毒载体相比要低得多,导致其转染相同细胞所用质粒载体用量要大大高于其它方法,造成入核质粒载体量难以控制,这也解释了为什么化学转染方法和其它两种方法比,更倾向于得到串联多拷贝。以上种种因素,导致使用非病毒载体转染方法构建稳定株,成功率低,稳定性差,稳定克隆株易出现不均一(含有非整合细胞)等缺点。

逆转录病毒载体由于整合率高,是非常理想的稳定株构建工具(表1)。而且通过控制逆转录病毒载体转导的实验条件,理论上可以确保每个细胞只有单拷贝插入。同时由于病毒载体是通过病毒重组酶将外源片段整合入染色体中,其整合特性和病毒自身整合特性非常相似:偏向于转录活跃区段,且整合后非常稳定,在传代100次后仍然保留在宿主基因组中。最重要的是整合几率和所有其它化学,物理转染方法比,增加5至6个数量,使得稳定株构建不再成为实验研究的障碍。由于整合几率非常高,所以很容易获得混合稳定株。

 

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