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**共沉淀解决方案你了解多少?

在科研界,**共沉淀(Co-IP)无疑是磨人的小妖精,小师弟说总是分分钟被虐的体无完肤,糟心的实验结果更是让实验汪们分分钟想去“狗带”。
一. 实验原理及优缺点
**共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
**共沉淀的设计理念是,假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员,那么利用这种蛋白的特异性抗体,就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来(常说的“pull-down”),进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。**共沉淀的特点可以概括为两点,是天然状态,**是蛋白复合物。
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优点


**共沉淀Co-IP

1.相互作用的蛋白质是经翻译后修饰的,处于天然状态;


2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;


3.可分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。


1.可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

2.两种蛋白质的结合可能有第三者在中间起桥梁作用;

3.在实验前预测目的蛋白是什么,以选择后检测的抗体,若预测不正确,实验就得不到结果。



 二. **共沉淀实验步骤

1.用RIPA裂解缓冲液裂解细胞;

2.用PBS配制成50%的protein A/G-agarose工作液;

3.在样品中以每1ml中加100μl的比例,加入50%的Protein A/G agarose工作液。水平摇床4℃摇动10min(该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白);

4.4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除protein A/G-agraose微球;

5.使用BCA法或者其他方法测定总蛋白的浓度;

6.加入体积的一抗,至总体积约为500μl;

8.用摇床缓慢摇动抗原抗体混合物,4℃过夜;注意:如果如果下游用于激酶或磷酸酶的酶活测定,则好将11步改为室温孵育2h;

9.14000g离心5s,收集沉淀,并且用预冷的洗涤缓冲液(或者预冷的PBS)洗涤3遍(每次加入800μl)

10.(用合适体积的上样缓冲液重悬)收集上清,用于进一步的下游SDS-PAGE、western-blot或者质谱分析。通过**共沉淀,确定结合蛋白。

三.常见问题解解决办法

1、抗体洗脱过多,怎么办?

解决办法:降低抗体用量;在进行IP前将抗体交联到珠子上;使用梯度甘氨酸缓冲洗脱液。

2、洗脱液中检测不到靶蛋白,怎么办?

原因
解决办法
标本中无靶蛋白表达,或者表达量非常低
根据蛋白表达资料确定检测标本中有靶蛋白的表达。如果蛋白表达水平很低,可以考虑增加裂解物的用量,但这样会增加非特异性结合。因此建议在进行IP前先对裂解物进行预纯化
所有抗体量不足,难以捕获靶蛋白
根据推荐量使用抗体,并根据实验结果优化抗体的用量.
靶蛋白没有从珠子上洗脱下来
确定使用正确的洗脱液并洗脱液的强度和pH值是适用于靶蛋白的
抗体没有和**吸附的珠子结合
确定使用正确的洗脱液并洗脱液的强度和pH值是适用于靶蛋白的
抗体没有和**吸附的珠子结合
根据说明书确定该抗体检测的是变性还是天然蛋白;然后所用裂解液是恰当的

3、未检测到目得蛋白或蛋白很少,怎么办?
原因
解决方法
样品被蛋白酶降解
添加蛋白酶抑制剂,所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融;
抗体浓度太低
调整IP和或IB抗体浓度,必要时设立浓度梯度,摸索佳浓度;
抗体亲和力太低
用审核与IP或IB的相应抗体
IP抗体未与agarose珠子结合
用适合于IP的相应珠子,正存防止变质或干燥
裂解液严谨度太高
用低严谨度裂解液

4、目得蛋白高背景,怎么办?

原因
解决办法
吸取了不溶于去污剂中的蛋白(沉淀)
离心后立刻吸取上清,如果发生了重悬,则需要再次离心
洗涤不
在洗涤过程中将试管盖好盖子,倒转混匀几次洗涤充分后再离心
非特异蛋白结合到珠子上了,珠子没有被充分封闭。
确定使用所有BSA(fraction V)是新鲜配制的,用1%BSA的PBS封闭新鲜准备的珠子1hr。进行IP前使用PBS洗涤3-4次
所用抗体纯度不够
使用亲和纯化的抗体,有限预吸附过的抗体
非特异性蛋白结合
在无血清培养液中裂解细胞,在**沉淀钱用protein(G/A)珠子预洗**沉淀后增加漂洗次数和严谨度(高盐或去垢剂)
在**沉淀过程中蛋白降解
本裂解时使用新鲜配制的蛋白抑制剂
实验仪器或液体被污染
使用结晶的仪器或液体

5、**沉淀应该如何配制细胞裂解液? 

答: 细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用或抗原的结构,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂。


四. 应用

1、肿瘤:鼻咽癌细胞中P53相结合蛋白质的分离和鉴定:**共沉淀与LC2ESI2MS/MS分析相结合的方法对HNE1细胞蛋白条带3鉴定的P53相互作用蛋白之一HSP78进行了验证。次在鼻咽癌细胞中鉴定了九个P53结合蛋白,为阐明鼻咽癌中P53蛋白聚集及失活的机制提供了重要依据和线索。

2、酶和病毒:应用**共沉淀技术验证新基因AngRem104和糖皮质**受体特异延伸因子蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用,为进一步研究AngRem104的生理功能奠定基础。
3、信号转导:通过**共沉淀证实了黑色素瘤相关抗原MAAT1p115与LRP6之间的相互作用。
4、寄生虫:**共沉淀证明了天然的PfPP5和恶性疟原虫的热休克蛋白90之间的相互作用,PfPP5在恶性疟原虫寄生生长和信号途径过程中起决定性作用。


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