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是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档,已成为研究蛋白质相互作用的经典方法。

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一、服务介绍

**共沉淀Co-Immunoprecipitation, Co-IP)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档,已成为研究蛋白质相互作用的经典方法。

二、**共沉淀实验原理

当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的很多蛋白质-蛋白质见的相互作用被保留下来。如果以细胞中某蛋白质为抗原,加入相应抗体,那么该抗体就能与抗原,以及与该抗原具有相互作用的蛋白质之间形成**复合物,一起沉淀下来。经过SDS-PAGE电泳,western blot和(或)质谱可鉴定出与抗原相互作用的蛋白质。

三、**共沉淀实验流程

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,后一次吸干PBS

2. 按比例加入适量预冷的RIPA 缓冲液;

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4°C,缓慢晃动(EP管插冰上,置水平摇床上);

4. 4°C离心后,立即将上清转移到一个新的离心管中;

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠;

6. 按比例加入Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10minEP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景;

7. 4°C离心后,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子;

8.用BCA法测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释110倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月);

9. 用PBS将总蛋白稀释到合适浓度;

10. 加入体积的预先稀释的一抗;

11. 4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育;

12. 加入Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h

13.瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的洗液(或PBS)洗3遍;

14. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

客户提供:

1、新鲜的样本材料(组织、细胞或蛋白溶液)

2、**沉淀的抗体(或由公司代购)及待测蛋白的相关信息

3、用于western blot的一抗

交付内容: 

实验报告:详细实验步骤、图片等。

服务列表

项目

备注

周期

Co-IP

含一个阳性蛋白和一个阴性蛋白检测

20个工作日

Western blot

包括蛋白提取,每张膜按8个样计算(其他三个为marker,阳性对照,阴性对照)

5个工作日


 




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